د فلوروسینس کمیتي PCR (د TaqMan PCR په نوم هم پیژندل کیږي، وروسته د FQ-PCR په نوم یادیږي) یوه نوې نیوکلیک اسید کمیتي ټیکنالوژي ده چې په 1995 کې په متحده ایالاتو کې د PE (Perkin Elmer) لخوا رامینځته شوې. دا ټیکنالوژي د فلوروسینټ لیبل شوي پروب په اضافه کولو سره د دودیز PCR پر بنسټ والړ ده.د انعطاف وړ PCR سره پرتله کول ، FQ-PCR د دې کمیتي فعالیت احساس کولو لپاره ډیری ګټې لري.دا مقاله په لنډ ډول د ټیکنالوژۍ ځانګړتیاوې، اصول، میتودونه او غوښتنلیکونه تشریح کوي.

1 ځانګړتیاوې

FQ-PCR نه یوازې د عادي PCR لوړ حساسیت لري، بلکې د فلوروسینټ پروبونو د پلي کولو له امله هم کولی شي د PCR امپلیفیکیشن په جریان کې د فلوروسینټ سیګنال بدلون په مستقیم ډول د فوتو الیکټریک کنډکشن سیسټم له لارې کشف کړي ترڅو کمیتي پایلې ترلاسه کړي، کوم چې د دودیز PCR ډیری نیمګړتیاوې له مینځه وړي، نو دا د لوړ سپیکروکوبری ټیکنالوژۍ او د ډی این اے سی سی سی ټیکنالوژۍ لوړ سپیکټریت هم لري.

د مثال په توګه، د PCR عمومي محصولات باید د اګاروز جیل الیکٹروفورسس او ایتیدیم برومایډ داغ د الټرا وایلیټ ر lightا یا پولی کریلامایډ جیل الیکٹروفورسیس او د سپینو زرو داغونو سره مشاهده شي.دا نه یوازې ډیری وسایلو ته اړتیا لري، بلکې وخت او هڅې هم اخلي.د ایتیډیم برومایډ کارول شوي داغونه د انسان بدن ته زیان رسوي، او دا پیچلې تجربې پروسیجرونه د ککړتیا او غلط مثبتو لپاره فرصتونه برابروي.په هرصورت، FQ-PCR یوازې د نمونې بارولو په جریان کې یو ځل د پوښ خلاصولو ته اړتیا لري، او ورپسې پروسه په بشپړه توګه تړل شوي ټیوب عملیات دی، کوم چې د PCR وروسته پروسس کولو ته اړتیا نلري، د دودیزو PCR عملیاتو کې د ډیری نیمګړتیاوو څخه مخنیوی کوي.تجربه عموما د ABI7100 PCR حرارتي سایکلر کاروي چې د PE شرکت لخوا رامینځته شوی.

وسیله لاندې ځانګړتیاوې لري: ① پراخه غوښتنلیک: دا د DNA او RNA PCR محصول اندازه کولو لپاره کارول کیدی شي، د جین بیان څیړنه، د رنځجن کشف، او د PCR شرایطو اصلاح کول.② ځانګړی کمیتی اصول: د فلوروسینټ لیبل شوي پروبونو په کارولو سره د فلوروسینس مقدار به د لیزر هڅونې وروسته د PCR دورې سره راټول شي ، ترڅو د مقدار کولو هدف ترلاسه شي.③ لوړ کاري موثریت: د 9600 PCR حرارتي سایکلر جوړ شوی، کمپیوټر له 1 څخه تر 2 ساعتونو پورې کنټرول شوی ترڅو د 96 نمونو پراخه کول او مقدار په اتوماتيک ډول او همغږي بشپړ کړي.④ جیل الیکٹروفورسیس ته اړتیا نشته: د نمونې ضعیف او الیکټروفوریسس ته اړتیا نشته ، یوازې د عکس العمل ټیوب کې مستقیم کشف کولو لپاره ځانګړي تحقیقات وکاروئ.⑤ په پایپ لاین کې ککړتیا نشته: د ځانګړي بشپړ تړل شوي عکس العمل ټیوب او د فوتو الیکټریک کنډکشن سیسټم غوره شوی ، نو د ککړتیا په اړه اندیښنه ته اړتیا نشته.⑥پایلې د بیا تولید وړ دي: د کمیت متحرک سلسله تر پنځو امرونو پورې اندازه ده.له همدې امله، کله چې دا ټیکنالوژي په بریالیتوب سره رامینځته شوې، دا د ډیری ساینسي څیړونکو لخوا ارزښت لري او په ډیرو برخو کې پلي شوي.

2 اصول او طریقې

د FQ-PCR کاري اصول د Taq انزایم د 5′→ 3′ exonuclease فعالیت څخه کار اخلي ترڅو د PCR عکس العمل سیسټم ته د فلوروسینټ لیبل شوي تحقیقات اضافه کړي.تحقیقات کولی شي په ځانګړي ډول د DNA ټیمپلیټ سره د پریمر ترتیب کې موجود وي.د تحقیقاتو 5 پایه د فلوروسینس اخراج جین FAM (6-carboxyfluorescein، 518nm کې د فلوروسینس اخراج چوکۍ) سره لیبل شوی، او 3′پای د fluorescence quenching Group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodence 518nm)، او 3′پای ته لیبل شوی دی. د تحقیقاتو پیل فاسفوریلیټ شوی ترڅو د PCR امپلیفیکیشن په جریان کې د تفتیش د پراخیدو مخه ونیسي.کله چې پروب ثابت پاتې شي، د quencher ګروپ د جذبونکي ګروپ فلوروسینس اخراج فشاروي.یوځل چې د اخراج ګروپ د quenching ګروپ څخه جلا شي، مخنیوی پورته کیږي، او د نظری کثافت په 518nm کې لوړیږي او د فلوروسینس کشف سیسټم لخوا کشف کیږي. د بیا رغونې مرحله کې، تحقیقات د DNA ټیمپلیټ سره هایبرډیز کوي، او د تاک انزایم د DNA د توسع کولو مرحلې سره د تمدید مرحله کې حرکت کوي.کله چې پروب قطع شي، د شنډولو اغیزه خوشې کیږي او د فلوروسینټ سیګنال خوشې کیږي.هرکله چې ټیمپلیټ کاپي کیږي ، یو تحقیقات پرې کیږي ، د فلوروسینټ سیګنال خوشې کیدو سره.څرنګه چې د خوشې شوي فلوروفورونو شمیر او د PCR محصولاتو شمیر ترمنځ یو له بل سره اړیکه شتون لري، دا تخنیک د ټیمپلیټ په سمه توګه اندازه کولو لپاره کارول کیدی شي.تجربوي وسیله عموما د ABI7100 PCR حرارتي سایکلر کاروي چې د PE شرکت لخوا رامینځته شوی ، او نور حرارتي سایکلرونه هم کارول کیدی شي.که چیرې د ABI7700 غبرګون ډول غبرګون سیسټم د تجربې لپاره وکارول شي، د عکس العمل بشپړولو وروسته، کمیتي پایلې په مستقیم ډول د کمپیوټر تحلیل له لارې ورکول کیدی شي.که تاسو نور حرارتي سایکلرونه کاروئ، تاسو اړتیا لرئ د فلوروسینس ډیکټور څخه کار واخلئ ترڅو په ورته وخت کې د عکس العمل ټیوب کې د فلوروسینس سیګنال اندازه کړئ ترڅو RQ+، RQ-، △RQ محاسبه کړئ.RQ+ د نمونې ټیوب د فلوروسینټ اخراج ګروپ د لومینیسینس شدت تناسب د شنډولو ګروپ د لمریزینټ شدت سره څرګندوي، RQ- په خالي ټیوب کې د دوو تناسب استازیتوب کوي، △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) د پی سی آر د نښې نښانې استازیتوب کوي وروسته له دې چې د فلو د پروسې په جریان کې د انفلاسیون پایلې بدل شي. .د فلوروسینټ پروبونو د معرفي کولو له امله، د تجربې ځانګړتیا د پام وړ ښه شوې.د تحقیقاتو ډیزاین باید عموما لاندې شرایط پوره کړي: ①د تحقیقاتو اوږدوالی باید شاوخوا 20-40 بیسونه وي ترڅو د پابندۍ ځانګړتیا یقیني کړي.②د GC اډو منځپانګه د 40% او 60% ترمنځ ده ترڅو د واحد نیوکلیوټایډ ترتیبونو د تکرار څخه مخنیوی وشي.③ د پریمرونو سره د هایبرډیزیشن یا اوورلیپ څخه مخنیوی وکړئ.④ د پروب او ټیمپلیټ ترمینځ د پابندۍ ثبات د پریمر او ټیمپلیټ ترمینځ د پابندۍ ثبات څخه ډیر دی ، نو د پروب Tm ارزښت باید لږترلږه د پریمر د Tm ارزښت څخه 5 ° C لوړ وي.برسېره پردې، د تحقیقاتو غلظت، د تحقیقاتو او ټیمپلیټ ترتیب تر مینځ هومولوژي، او د پروب او پریمر ترمنځ فاصله ټول په تجربوي پایلو اغیزه لري.

اړوند توليدات:

د چین Lnc-RT Heroᵀᴹ I (د gDNase سره) (د lncRNA څخه د لومړي سټینډ cDNA ترکیب لپاره سوپر پریمکس) جوړونکی او عرضه کونکی |Foregene (foreivd.com)

د چین ریښتیني وخت PCR Easyᵀᴹ-تقمان جوړونکی او عرضه کونکی |Foregene (foreivd.com)