د qPCR تجربو کې، د پریمر ډیزاین هم خورا مهم لینک دی.ایا پریمر مناسب دي یا نه د دې سره نږدې تړاو لري چې ایا د لوړولو موثریت معیار ته رسي ، ایا پراخه شوي محصولات ځانګړي دي ، او ایا تجربې پایلې شتون لري.
نو څنګه د qPCR پریمر ځانګړتیا غوره کړئ؟د لوړ لوړولو موثریت؟
نن ورځ، موږ به تاسو سره یو ځای د qPCR پرائمر ډیزاین کولو لپاره ونیسو، او اجازه راکړئ چې د qPCR پریمر ډیزاین په تجربو کې یو اغیزمن مهارت شي.
کله چې د qPCR پرائمر ډیزاین کول، معمولا لاندې ټکو ته پام وکړئ: پرائمر باید د امکان تر حده د انټرونونو په اوږدو کې ډیزاین شي، د محصول اوږدوالی باید 100-300 bp وي، د Tm ارزښت باید د امکان تر حده تر 60 درجو پورې نږدې وي، او د پورته او ښکته پرائمر باید د امکان تر حده نږدې وي، او د پریمر پای باید G یا C وي، او داسې نور.
1. د پرائمرونو ډیزاین چې په انټرونونو کې پراخیږي
کله چې د qPCR پرائمر ډیزاین کول، د انټرونونو په اوږدو کې ډیزاین شوي پرائمرونه غوره کول کولی شي د gDNA ټیمپلیټ د پراخیدو مخه ونیسي، او محصولات ټول د cDNA د پراخولو څخه اخیستل شوي، پدې توګه د gDNA ککړتیا له منځه وړل کیږي.
2. د پریمر اوږدوالی
د پریمر اوږدوالی عموما د 18-30 nt تر منځ وي، او د امپلیفیکیشن محصول اوږدوالی باید د 100-300 bp تر منځ څومره چې امکان ولري کنټرول شي.
که چیرې پریمر ډیر لنډ وي، نو دا به د غیر مشخص پراخوالي لامل شي، او که دا ډیر اوږد وي، دا به په اسانۍ سره ثانوي جوړښت (لکه د ویښتو جوړښت) جوړ کړي.که د امپلیفیکیشن محصول ډیر اوږد وي ، دا د پولیمیریز عکس العمل لپاره مناسب ندي ، کوم چې د PCR امپلیفیکیشن موثریت اغیزه کوي.
3. د GC منځپانګې او د Tm ارزښت
د پریمرونو GC مواد باید د 40٪ او 60٪ ترمنځ کنټرول شي.که دا ډیر لوړ یا ډیر ټیټ وي، دا د غبرګون پیل کولو لپاره مناسب نه دی.د مخکینۍ او شاته پریمرونو GC مینځپانګه باید ورته نږدې وي ترڅو ورته Tm ارزښت او د انیل کولو تودوخې ترلاسه کړي.
د Tm ارزښت باید د امکان تر حده د 55-65 ° C ترمنځ وي، عموما د 60 ° C شاوخوا، او د پورته او ښکته جریان د Tm ارزښت باید د امکان تر حده نږدې وي، په غوره توګه د 4 درجو څخه زیات نه وي.
4. د پریمر په 3′ پای کې د A غوره کولو څخه ډډه وکړئ
کله چې د پریمر 3′ پای سره سمون نه خوري، د مختلفو اډو د ترکیب موثریت کې لوی توپیرونه شتون لري.کله چې وروستی بیس A وي، دا کولی شي د زنځیر ترکیب هم پیل کړي حتی د بې سمونۍ په حالت کې، او کله چې وروستی بیس T When وي، د بې مطابقت د انډکشن موثریت خورا کم شوی.له همدې امله، هڅه وکړئ چې د پریمر په 3′ پای کې د A غوره کولو څخه ډډه وکړئ، او دا غوره ده چې T غوره کړئ.
که دا د تحقیقاتو پرائمر وي، د تحقیقاتو 5′ پای نشي کولی G وي، ځکه چې حتی کله چې یو واحد G بیس د FAM فلوروسینټ راپور ورکوونکي ګروپ سره وصل وي، G هم کولی شي د FAM ګروپ لخوا خارج شوي فلوروسینټ سیګنال مات کړي، چې د غلط منفي پایلې سبب کیږي.ښکاري.
5. د بنسټ ویش
په پرائمر کې د څلورو بیسونو ویش په غوره توګه تصادفي دی، په 3′ پای کې د 3 پرله پسې G یا C څخه ډډه کول، او له 3 څخه ډیر پرله پسې.G یا C د GC بډایه ترتیب سیمه کې د جوړه کولو لپاره اسانه دي.
6. د پریمر ډیزاین سیمه باید د پیچلو ثانوي جوړښتونو څخه ډډه وکړي.
ثانوي جوړښت چې د امپلیفیکیشن محصول د واحد سټینډ لخوا رامینځته شوی د PCR اسانه پرمختګ اغیزه کوي.د وړاندوینې په کولو سره چې ایا دمخه د هدف په ترتیب کې ثانوي جوړښت شتون لري ، هڅه وکړئ د پریمرونو په ډیزاین کې د دې سیمې څخه مخنیوی وکړئ.
7. پریمرونه پخپله او د پریمرونو ترمینځ باید هڅه وکړي چې د پرله پسې تکمیلي اډو څخه ډډه وکړي.
د پرائمر او پریمر تر مینځ هیڅ پرله پسې 4 اساس بشپړونکي شتون نلري.پخپله پریمر باید بشپړونکي ترتیب ونلري، که نه نو دا به ځان د ویښتو جوړښت رامینځته کولو لپاره ودروي، کوم چې به د پریمر او ټیمپلیټ انیل کولو ترکیب اغیزه وکړي.
بشپړونکي ترتیبونه د پورته او ښکته جریان پرائمرونو ترمینځ شتون نلري.د پریمرونو تر مینځ بشپړتیا به د پریمر ډیمر تولید کړي، کوم چې به د PCR موثریت کم کړي او حتی د کمیت دقت اغیزه وکړي.که چیرې د پریمر-ډیمر او ویښتو جوړښتونه د مخنیوي وړ نه وي، د △G ارزښت باید ډیر لوړ نه وي (باید له 4.5 kcal/mol څخه کم وي).
8. پریمر د هدف مشخص محصول پراخوي.
د qPCR کشف کولو وروستی هدف د هدف جین په کثرت پوهیدل دي.که چیرې غیر مشخص پراخوالی واقع شي، نو مقدار به ناسم وي.نو ځکه، وروسته له دې چې پرائمرونه ډیزاین شوي، دوی باید د BLAST لخوا ازموینه وشي، او د محصول ځانګړتیا د ترتیب ډیټابیس کې پرتله کیږي.
بیا، موږ د انسان GAS6 (د ودې نیول ځانګړي 6) جین د qPCR پرائمر ډیزاین کولو لپاره د مثال په توګه اخلو.
01 د پوښتنې جین
Homo GAS6د NCBI له لارې.دلته، موږ باید د جین نوم او ډولونو پرتله کولو ته پام وکړو ترڅو ډاډ ترلاسه کړو چې دوی مطابقت لري.
02 د جین ترتیب پیدا کړئ
(1) که د هدف ترتیب جینومیک DNA وي، لومړی یې غوره کړئ، کوم چې د جین د جینومیک DNA ترتیب دی.
(2) که د هدف ترتیب mRNA وي، دوهم غوره کړئ.د ننوتلو وروسته، په لاندې جدول کې "CDS" کلیک وکړئ.د نسواري پس منظر ترتیب د جین د کوډ کولو ترتیب دی.
03 ډیزاین پریمر
پریمر-بلاسټ انٹرفیس داخل کړئ
په پورتنۍ کیڼ اړخ کې د فاسټا بڼه کې د جین ترتیب شمیره یا ترتیب دننه کړئ، او اړونده پیرامیټونه ډک کړئ.

"پرائمرونه ترلاسه کړئ" کلیک وکړئ او NCBI به تاسو ته ووایی چې دا ډول پیرامیټر انتخاب به نورو جلا کولو ډولونو ته پراخه شي.موږ کولی شو د جلا کولو مختلف ډولونه وګورو او د مناسب پریمر جوړه ترلاسه کولو لپاره یې وسپارو (لکه څنګه چې په لاندې شکل کې ښودل شوي).دا پروسه ممکن د چلولو لپاره لسګونه ثانیې وخت ونیسي.
د دې پرائمر جوړه د انیل کولو تودوخې ټول شاوخوا 60 درجې سانتي ګراد دي.د تجربې د موخې له مخې، د تجربې لپاره د منځني اوږدوالي، ښه ځانګړتیا او لږ ځان بشپړولو سره پرائمرونه غوره کړئ، او د بریالیتوب کچه خورا لوړه ده!
04 د پرائمر ځانګړتیا تصدیق
په حقیقت کې، د پریمرونو ډیزاین کولو سربیره، پریمر-بلاسټ کولی شي هغه پریمرونه هم ارزونه وکړي چې موږ پخپله ډیزاین کړي.د پریمر ډیزاین پا pageې ته بیرته راشئ ، د پورته او ښکته جریان پریمرونه دننه کړئ چې موږ ډیزاین کړي ، او نور پیرامیټونه به تنظیم نشي.د سپارلو وروسته، تاسو کولی شئ وګورئ چې د پریمرونو جوړه په نورو جینونو کې هم شتون لري.که دا ټول په جین کې ښودل شوي وي چې موږ یې پراخول غواړو، دا په ګوته کوي چې د دې جوړه پرائمر ځانګړتیا خورا ښه ده!(د مثال په توګه، دا د پریمر پوښتنې یوازینۍ پایله ده!)

05 د لومړني کیفیت قضاوت
کوم ډول پریمر "کامل" پریمر دی چې "تر معیاري پورې د لوړولو موثریت" ، "پرمختللي محصول ځانګړتیاوې" ، او "د باور وړ تجربې پایلې" ترکیب کوي؟
د لوړولو موثریت

منحنی منحنی
د پریمرونو د امپلیفیکیشن موثریت 90%-110% ته رسیږي، پدې معنی چې د امپلیفیکیشن موثریت ښه دی، او د خټکي وکر یو واحد لوړوالی لري او معمولا Tm> 80 ° C، پدې معنی چې د پراخولو ځانګړتیا ښه ده.
 
اړوند توليدات:
د ریښتیني وخت PCR اسانه – SYBR ګرین I
د ریښتیني وخت PCR اسانه-تقمان