د مالیکولر تشخیص ټیکنالوژي د مالیکولر بیولوژي میتودونه کاروي ترڅو د انسان بدن او مختلف رنځونو جینیاتي موادو بیان او جوړښت کشف کړي ، ترڅو د ناروغیو وړاندوینې او تشخیص هدف ترلاسه کړي.

په وروستي کلونو کې ، د مالیکولر تشخیص ټیکنالوژۍ لوړولو او تکرار سره ، د مالیکولر تشخیص کلینیکي غوښتنلیک خورا پراخه او ژور شوی ، او د مالیکولر تشخیص بازار د ګړندي پرمختګ دورې ته داخل شوی.

لیکوال په بازار کې د عام مالیکولر تشخیص ټیکنالوژۍ لنډیز وړاندې کوي، او په دریو برخو ویشل شوي: لومړۍ برخه د PCR ټیکنالوژي معرفي کوي، دویمه برخه د نیوکلیک اسید isothermal امپلیفیکیشن ټیکنالوژي معرفي کوي، او دویمه برخه د ترتیب کولو ټیکنالوژي معرفي کوي.

01

لومړۍ برخه: د PCR ټیکنالوژي

د PCR ټیکنالوژي

PCR (د پولیمیریز چین عکس العمل) د ویټرو DNA امپلیفیکیشن ټیکنالوژیو څخه دی چې د 30 کلونو څخه ډیر تاریخ لري.

د PCR ټیکنالوژي په 1983 کې د متحده ایالاتو د Cetus د کیري مولیس لخوا پیل شوه.مولیس په 1985 کې د PCR پیټینټ لپاره غوښتنه وکړه او په ورته کال کې یې د ساینس په اړه د PCR لومړنۍ علمي مقاله خپره کړه.مولیس په ۱۹۹۳ کال کې د کیمیا په برخه کې د نوبل جایزه وګټله.

د PCR اساسی اصول

PCR کولی شي د هدف DNA ټوټې له یو ملیون څخه ډیر ځله پراخه کړي.اصل دا دی چې د DNA پولیمیریز د کتلیزیز لاندې، د اصلي سټرنډ DNA د ټیمپلیټ په توګه کارول کیږي، او یو ځانګړی پریمر د تمدید لپاره د پیل ټکي په توګه کارول کیږي.دا په ویټرو کې د ګامونو له لارې نقل کیږي لکه د ډینیټوریشن ، اینیلینګ ، او توسیع.د لور سټرنډ DNA پروسه د پلار سټرینډ ټیمپلیټ DNA تکمیلوي.

د معیاري PCR پروسه په دریو مرحلو ویشل شوې ده:

1. تخریب: د DNA ډبل سټنډونو جلا کولو لپاره د لوړې تودوخې څخه کار واخلئ.د DNA ډبل سټنډونو تر مینځ د هایدروجن بانډونه په لوړه تودوخه (93-98 درجې C) کې مات شوي.

2. annealing: وروسته له دې چې دوه اړخیزه DNA جلا شي، د تودوخې درجه ټیټه شوې ترڅو پریمر د واحد ډنډ شوي DNA سره وصل شي.

3. تمدید: د DNA پولیمیریز د بشپړونکي تارونو په ترکیب پیل کوي کله چې د تودوخې درجه راټیټه شي د پرائمر سره تړل شوي د DNA سټینډونو سره یوځای کیږي.کله چې تمدید بشپړ شي، یو دوره بشپړه شوې، او د DNA ټوټې دوه چنده کیږي.

د دې دریو مرحلو 25-35 ځله تکرار کول، د DNA ټوټې شمیر به په چټکۍ سره زیات شي.

د PCR هوښیارتیا دا ده چې مختلف پریمرونه د مختلف هدف جینونو لپاره ډیزاین کیدی شي ، ترڅو د هدف جین ټوټې په لنډ وخت کې پراخه شي.

تر اوسه پورې، PCR په دریو کټګوریو ویشل کیدی شي، د بیلګې په توګه عادي PCR، فلوروسینټ کمیتي PCR او ډیجیټل PCR.

د عادي PCR لومړی نسل

د هدف جین پراخولو لپاره د عادي PCR امپلیفیکیشن وسیله وکاروئ ، او بیا د محصول کشف کولو لپاره د اګرز جیل الیکٹروفورسیس وکاروئ ، یوازې کیفي تحلیل ترسره کیدی شي.

د لومړي نسل PCR اصلي زیانونه:

- د غیر مشخص پراخوالي او غلط مثبت پایلو لپاره حساس.

- کشف ډیر وخت نیسي او عملیات پیچلي دي.

- یوازې کیفیتي ازموینه ترسره کیدی شي.

د دوهم نسل فلوروسینس مقداری PCR

د فلوروسینس مقداري PCR (ریښتیني وخت PCR) چې د qPCR په نوم هم پیژندل کیږي ، د فلوروسینټ سیګنالونو د راټولولو له لارې د فلوروسینټ پروبونو په اضافه کولو سره د پراخه محصولاتو راټولولو نظارت کولو لپاره کارول کیږي چې کولی شي د عکس العمل سیسټم پرمختګ په ګوته کړي ، او د فلوروسینس منحني له لارې د پایلو قضاوت وکړي ، او دا د C معیاري منحني ارزښت سره مرسته کولی شي.

ځکه چې د qPCR ټیکنالوژي په تړل شوي سیسټم کې ترسره کیږي، د ککړتیا احتمال کم شوی، او د فلوروسینس سیګنال د کمیتي کشف لپاره وڅیړل شي، نو دا په کلینیکي تمرین کې ترټولو پراخه کارول کیږي او په PCR کې غالب ټیکنالوژي ګرځیدلی.

فلوروسینټ مواد چې په ریښتیني وخت کې د فلوروسینټ مقداري PCR کې کارول کیږي په لاندې برخو ویشل کیدی شي: TaqMan فلوروسینټ پروبونه، مالیکولر بیکنز او فلوروسینټ رنګونه.

1) TaqMan فلوروسینټ تحقیقات:

د PCR امپلیفیکیشن په جریان کې ، یو ځانګړی فلوروسینټ پروب اضافه کیږي پداسې حال کې چې یو جوړه پریمر اضافه کوي.پروب یو oligonucleotide دی، او دواړه پایونه په ترتیب سره د ریپورټر فلوروسینټ ګروپ او د quencher fluorescent ګروپ سره لیبل شوي.

کله چې تحقیقات ثابت وي، د راپور ورکوونکي ګروپ لخوا خارج شوي فلوروسینټ سیګنال د شنډولو ګروپ لخوا جذب کیږي؛د PCR امپلیفیکیشن په جریان کې، د Taq انزایم 5′-3′ exonuclease فعالیت د تحقیقاتو ټوټه ټوټه کوي او تخریب کوي، د راپور ورکوونکي فلوروسینټ ګروپ جوړوي او د فلوروسینټ ګروپ جلا کوي، د دې لپاره چې د فلوروسینټ نظارت سیسټم کولی شي د فلوروسینټ سیګنال ترلاسه کړي، دا دی، هرکله چې د ډی این فلوسنټ شکل وي او هر وخت د امکلوریسټ شکل وي. د فلوروسینس سیګنال راټولول په بشپړ ډول د PCR محصول رامینځته کولو سره همغږي کیږي.

2) د SYBR فلوروسینټ رنګونه:

د PCR غبرګون سیسټم کې، د SYBR فلوروسینټ رنګ اضافه کیږي.وروسته له دې چې د SYBR فلوروسینټ رنګ په غیر مشخص ډول د DNA ډبل سټرینډ کې شامل نه شو ، دا د فلوروسینټ سیګنال خپروي.د SYBR رنګ مالیکول چې په زنځیر کې شامل شوی نه وي هیڅ فلوروسینټ سیګنال نه خپروي ، پدې توګه د فلوروسینټ سیګنال ډاډ ترلاسه کوي د PCR محصولاتو زیاتوالی په بشپړ ډول د PCR محصولاتو زیاتوالي سره همغږي کیږي.SYBR یوازې دوه ګونی ډنډ شوي DNA پورې تړلی دی، نو د خټکي وکر د دې لپاره کارول کیدی شي چې معلومه کړي چې آیا د PCR غبرګون ځانګړی دی.

3) مالیکولر بیکنز

دا د ډډ لوپ دوه ګونی لیبل شوی اولیګونیوکلیوټایډ پروب دی چې په 5 او 3 پایونو کې د شاوخوا 8 بیسونو ویښتو جوړښت جوړوي.په دواړو سرونو کې د نیوکلیک اسید سلسله په بشپړ ډول جوړه شوې، چې د فلوروسینټ ګروپ او د شنډولو ګروپ د سختیدو لامل کیږي.تړل، دا به فلوروسینس تولید نه کړي.

وروسته له دې چې د PCR محصول تولید شي، د انیل کولو پروسې په جریان کې، د مالیکولر بیکون منځنۍ برخه د ځانګړي DNA ترتیب سره جوړه شوې، او فلوروسینټ جین د quencher جین څخه جلا کیږي ترڅو فلوروسینس تولید کړي.

د دوهم نسل PCR اصلي زیانونه:

حساسیت لاهم کم دی، او د ټیټ کاپي نمونو کشف سم نه دی.

د شاليد ارزښت نفوذ شتون لري، او پایله د مداخلې لپاره حساسه ده.

دریم نسل ډیجیټل PCR

ډیجیټل PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) د پای ټکي کشف کولو له لارې د هدف ترتیب کاپي شمیره محاسبه کوي ، او کولی شي د داخلي کنټرولونو او معیاري منحني کارولو پرته دقیق مطلق کمیتي کشف ترسره کړي.

ډیجیټل PCR د پای ټکي کشف کاروي او د Ct ارزښت (سایکل حد) پورې اړه نلري ، نو د ډیجیټل PCR عکس العمل د امپلیفیکیشن موثریت لخوا لږ اغیزمن کیږي ، او د PCR عکس العمل مخنیوی کونکو ته زغم ښه شوی ، د لوړ دقت او تولید وړتیا سره.

د لوړ حساسیت او لوړ دقت د ځانګړتیاوو له امله، دا د PCR غبرګون مخنیوی کونکو لخوا په اسانۍ سره مداخله نه کوي، او دا کولی شي د معیاري محصولاتو پرته ریښتینې مطلق مقدار ترلاسه کړي، کوم چې د څیړنې او غوښتنلیک هټ سپټ ګرځیدلی.

د غبرګون واحد د مختلفو بڼو له مخې، دا په دریو ډولونو ویشل کیدی شي: مایکرو فلوډیک، چپ او څاڅکي سیسټمونه.