د Ct ارزښت د فلوروسینټ کمیتي PCR ترټولو مهم پایلې وړاندې کولو بڼه ده.دا د جین بیان توپیر یا د جین کاپي شمیره محاسبه کولو لپاره کارول کیږي.نو د فلوروسینس مقدار کولو د Ct ارزښت کوم معقول ګڼل کیږي؟څنګه د Ct ارزښت اغیزمن حد ډاډمن کړئ؟
د Ct ارزښت څه شی دی؟
د qPCR امپلیفیکیشن پروسې په جریان کې ، د امپلیفیکیشن دورې اړونده شمیره (د سایکل حد) کله چې د لوړ شوي محصول فلوروسینس سیګنال ټاکل شوي فلوروسینس حد ته ورسیږي.C د سایکل لپاره ولاړ دی او T د حد لپاره ولاړ دی.په ساده ډول ووایاست، د Ct ارزښت د سایکلونو شمیر دی چې ورته ورته وي کله چې د لومړني ټیمپلیټ امپلیفیکیشن په qPCR کې د محصول یوې ټاکلې اندازې ته ورسیږي.تش په نامه "د محصول یو ټاکلی مقدار" به وروسته تشریح شي.
د Ct ارزښت څه کوي؟
1. د توزیع امپلیفیکیشن، د نمونې مقدار او د Ct ارزښت ترمنځ اړیکه
په عین حال کې، په qPCR کې جینونه د یو ټاکلي شمیر دورې وروسته د اضطراري امپلیفیکیشن لخوا راټول شوي.د امپلیفیکیشن دورې د شمیر او د محصولاتو مقدار ترمینځ اړیکه دا ده: پراخه شوي محصول اندازه = د لومړني ټیمپلیټ مقدار × (1+En) دورې شمیره.په هرصورت، د qPCR غبرګون تل په یو مثالي حالت کې نه وي.کله چې د پراخ شوي محصول اندازه د "ځانګړي محصول مقدار" ته ورسیږي، پدې وخت کې د دورې شمیره د Ct ارزښت دی، او دا د اضافې پراخولو دوره کې ده.د Ct ارزښت او د پیل شوي ټیمپلیټ مقدار تر مینځ اړیکه: د کينډۍ د Ct ارزښت او د ټیمپلیټ د پیل شوي کاپي شمیرې لوګاریتم ترمنځ یو خطي اړیکه شتون لري.هرڅومره چې د لومړنۍ نمونې غلظت لوړ وي ، د Ct ارزښت کوچنی وي؛هرڅومره چې د لومړنۍ نمونې غلظت ټیټ وي ، د Ct ارزښت خورا لوی وي.
2. امپلیفیکیشن وکر، د فلوروسینس حد او د PCR د محصول اندازه
د qPCR امپلیفیکیشن محصول مقدار مستقیم د فلوروسینټ سیګنال په شکل کې وړاندې کیږي ، دا د امپلیفیکیشن وکر دی.د PCR په لومړیو مرحلو کې، پراخوالی د مثالی شرایطو لاندې دی، د دورې شمیر کوچنی دی، د محصول راټولول کوچنی دی، او د فلوروسینس کچه په روښانه توګه د فلوروسینس پس منظر څخه توپیر نشي کولی.له هغې وروسته، فلوروسینس زیاتیږي او د توقیف پړاو ته ننوځي.د PCR محصول اندازه په یو ټاکلي نقطه کې کشف کیدی شي کله چې د PCR عکس العمل یوازې د توزیع مرحله کې وي ، کوم چې د "د محصول یو ټاکلی مقدار" په توګه کارول کیدی شي ، او د ټیمپلیټ لومړني مینځپانګه له دې څخه محاسبه کیدی شي.له همدې امله، د فلوروسینس سیګنال شدت د محصول د ټاکلې اندازې سره مطابقت لري د فلوروسینس حد دی.
د PCR په وروستي پړاو کې، د امپلیفیکیشن وکر نور د اضطراري امپلیفیکیشن نه ښیې، او خطي پړاو او پلیټیو پړاو ته ننوځي.
3. د Ct ارزښتونو د تولید وړتیا
کله چې د PCR دوره د Ct ارزښت د دورې شمیرې ته ورسیږي، دا یوازې د ریښتینې اضافې پراخولو دورې ته داخل شوی.په دې وخت کې، کوچنۍ تېروتنه نه ده پراخه شوې، نو د Ct ارزښت د تولید وړتیا خورا ښه ده، دا دی، ورته ټیمپلیټ په مختلفو وختونو کې یا په ورته وخت کې په مختلفو ټیوبونو کې پراخ شوی.پراخوالی، ترلاسه شوی Ct ارزښت ثابت دی.
1. د پراخولو موثریت En
د PCR امپلیفیکیشن موثریت هغه موثریت ته اشاره کوي چې ورسره پولیمیریز جین بدلوي ترڅو په امپلیکون کې پراخه شي.کله چې یو DNA مالیکول په دوه DNA مالیکولونو بدل شي د امپلیفیکیشن موثریت 100٪ دی.د پراخولو موثریت عموما د En په توګه څرګندیږي.د دې لپاره چې د راتلونکو مقالو تحلیل اسانه کړي، هغه فکتورونه چې د لوړولو موثریت اغیزه کوي په لنډه توګه معرفي کیږي.
| د اغیزو عوامل | وضاحت | څنګه قضاوت وکړو؟ |
| A. د PCR مخنیوی کونکي | 1. د DNA نمونه هغه مواد لري چې د PCR غبرګون منع کوي، لکه پروټینونه یا صابون.2. د ریورس ټرانسکرپشن وروسته cDNA د ټیمپلیټ RNA یا RT ریجنټ اجزاو ډیر غلظت لري، کوم چې کیدای شي د PCR د تعقیب مخنیوی هم وکړي. | 1. آیا ککړتیا شتون لري د A260/A280 او A260/A230 یا RNA الکتروفوریسس تناسب په اندازه کولو سره قضاوت کیدی شي.2. ایا cDNA د یو ټاکلي تناسب سره سم د بیرته راګرځیدو وروسته کم شوی. |
| B. د پرائمر ناسم ډیزاین | پریمر په مؤثره توګه انیل نه کوي | د پریمر - ډیمرونو یا ویښتو پنونو لپاره پرائمرونه چیک کړئ، بې سمونې، او ځینې وختونه د داخلي ډیزاینونو پراخول. |
| ج. د PCR د عکس العمل پروګرام ناسم ډیزاین | 1. پرائمر نشي کولی په مؤثره توګه انیل کړي2. د DNA پولیمریز ناکافي خوشې کول 3. د اوږدې مودې لوړ حرارت DNA پولیمریز فعالیت کم شوی | 1. د انیل کولو تودوخه د پریمر د TM ارزښت څخه لوړه ده2. د سپارلو دمخه وخت ډیر لنډ دی 3. د غبرګون د پروسې د هرې مرحلې وخت ډیر اوږد دی |
| D. د ریجنټ ناکافي مخلوط یا د پایپټینګ غلطی | د عکس العمل په سیسټم کې د PCR عکس العمل اجزاو محلي غلظت خورا لوړ یا غیر مساوي دی ، چې په پایله کې د PCR امپلیفیکیشن غیر اضطراري تعادل رامینځته کیږي. | |
| E. امپلیکون اوږدوالی | د امپلیکون اوږدوالی ډیر اوږد دی، د 300bp څخه ډیر دی، او د امپلیفیکیشن موثریت ټیټ دی | وګورئ چې د امپلیکون اوږدوالی د 80-300bp ترمنځ دی |
| F. د qPCR reagents نفوذ | په ریجنټ کې د DNA پولیمریز غلظت کم دی یا په بفر کې د آیون غلظت مطلوب نه دی ، په پایله کې د Taq انزایم فعالیت اعظمي حد ته نه رسیږي. | د معیاري وکر په واسطه د لوړولو موثریت معلومول |
2. د Ct ارزښتونو لړۍ
د Ct ارزښتونه د 15-35 پورې دي.که چیرې د Ct ارزښت له 15 څخه کم وي، نو دا په پام کې نیول کیږي چې پراخوالی د اساسی دورې په حد کې دی او د فلوروسینس حد ته نه دی رسیدلی.په عین حال کې، د Ct ارزښت او د ټیمپلیټ د لومړني کاپي شمیرې لوګاریتم ترمنځ یو خطي اړیکه شتون لري، دا معیاري منحنی دی.د معیاري منحني له لارې، کله چې د لوړولو موثریت 100٪ وي، د جین د واحد کاپي شمیرې اندازه کولو لپاره د Ct محاسبه شوي ارزښت شاوخوا 35 دی. که دا د 35 څخه ډیر وي، د ټیمپلیټ لومړنۍ کاپي شمیره په تیوریکي توګه د 1 څخه کم وي، کوم چې بې معنی ګڼل کیدی شي.
د مختلف جین Ct رینجونو لپاره، د جین کاپي شمیرې او د ابتدايي ټیمپلیټ مقدار کې د لوړولو موثریت کې د توپیر له امله، دا اړینه ده چې د جین لپاره یو معیاري وکر جوړ کړي او د جین د خطي کشف رینج محاسبه کړي.
3. د Ct ارزښت اغیزناک عوامل
د امپلیفیکیشن دورې د شمیر او د محصول مقدار ترمینځ اړیکې څخه: د تولید شوي محصول اندازه = د ابتدايي ټیمپلیټ مقدار × (1+En) دورې شمیره ، دا لیدل کیدی شي چې په مثالي شرایطو کې ، د لومړني ټیمپلیټ مقدار او En به د Ct ارزښت باندې منفي اغیزه وکړي.د ټیمپلیټ کیفیت یا امپلیفیکیشن موثریت کې توپیر به د Ct ارزښت ډیر لوی یا ډیر کوچنی لامل شي.
4. د Ct ارزښت ډیر لوی یا ډیر کوچنی دی
د پوسټ وخت: فبروري-22-2023
