RT-qPCR د مالیکولر بیولوژي لومړنۍ تجربه ده، او هرڅوک باید ورسره اشنا وي.پدې کې په عمده ډول درې مرحلې شاملې دي: د RNA استخراج، په cDNA کې د نقل نقل کول، او د ریښتیني وخت فلوروسینټ کمیتي PCR.دا مرسته نه کوي، څه روان دي؟دا احتمال شته چې ستونزه شتون ولريد برعکس لیږد تجربه!که څه هم داسې ښکاري چې د برعکس لیږد تجربه یوازې د RNA، dNTP، پریمرونو، او اضافه کولو ته اړتیا لريریورس ټرانسکریټیزد سینټرفیوج ټیوب ته او ښه مخلوط کړئ، مګر د اصلي عملیاتو په بهیر کې، لاهم ډیری توضیحات شتون لري چې باید ورته پاملرنه وشي.راځئ چې په اړه یې زده کړو!

د RNA کیفیت څنګه قضاوت وکړو؟
د cDNA ترلاسه کولو لپاره، د RNA کیفیت مهم دی!د RNA کیفیت په عمده توګه د دوو اړخونو څخه کشف کیدی شي:
(1) د RNA بشپړتیا:د RNA بشپړتیا د اګرز جیل الیکٹروفورسیس لخوا تایید کیدی شي. د مثال په توګه د eukaryotes په نظر کې نیولو سره، بشپړ ټول RNA درې روښانه بانډونه لري، د لوی څخه کوچني مالیکولر وزنونه 28S، 18S، او 5S دي، او 28S د 18S په پرتله دوه چنده روښانه دي؛که چیرې درې بانډونه لیدل کیدی شي، مګر د بانډ ډول تور دی یا د ډیفیوژن معنی دا ده چې RNA په جزوي توګه تخریب شوی.په دې وخت کې، مهرباني وکړئ سمدلاسه د ریورس لیږد عکس العمل ترسره کړئ او د ټیمپلیټ داخل په مناسب ډول زیات کړئ؛که چیرې یوازې یو بانډ د کوچني مالیکولر وزن سره یا هیڅ بانډ ونه لیدل شي ، RNA په بشپړ ډول تخریب شوی او بیا استخراج ته اړتیا لري.Agilent 2100 د لوړ ډیاګرام او RIN ارزښت سره د RNA بشپړتیا په ګوته کوي.که چیرې نیوکلیک اسید ثابت وي، د الکترو فیروگرام بیس لاین فلیټ دی؛که چیرې نیوکلیک اسید په جدي ډول تخریب شي، بیس لاین غیر مساوي وي او د تخریب لوړې څوکې څرګندیږي؛د RIN ارزښت د RNA بشپړتیا منعکس کوي، د 0-10 په رینج کې، څومره چې ارزښت لوی وي، د RNA کیفیت ښه وي.ښه، د بشپړتیا کچه لوړه ده.
(2) د RNA پاکوالی:د OD260/280 نسبت د UV spectrophotometry لخوا کشف کیدی شي.که د OD260/280 تناسب د 1.9 او 2.1 ترمنځ وي، نو پاکتیا خورا ښه ده.
پاتې جینومیک DNA کولی شي د غلط کمیتي پایلو لامل شي
کله چې RNA استخراج شي، هغه RNA چې موږ یې ترلاسه کوو ممکن د جینومیک DNA (gDNA) سره مخلوط شي چې پاک شوی نه وي.له همدې امله، د ریورس لیږد وروسته cDNA به هم سره مخلوط شيgDNA.د ښکته کیدو په جریان کېqPCRغبرګونcDNAاو gDNA کیدای شي په ورته وخت کې پراخ شي، د نسبتا کوچني CT ارزښت په پایله کې، نو پایلې ممکن تعصب وي.
نو په دې حالت کې باید څه وکړو؟فارجینوړاندیز کوي:
(1) په بدل شوي RNA کې د جینوم پاکول ترسره کړئ، کوم چې د RNA استخراج په وخت کې د کالم استخراج له لارې لرې کیدی شي؛
(2) استخراج شوي RNA د DNase سره درملنه وکړئI ، مګر دا د EDTA سره ختم کړئ؛
د ریورس لیږد ریجنټونود جینوم پاکولو ماډلونو سره؛

د ریورس لیږد لپاره پریمر څنګه غوره کړئ؟
د ریورس ټرانسکرپشن پرائمر هم د ریورس لیږد عکس العمل پایله اغیزه کوي.تاسو کولی شئ د تجربې د ځانګړو شرایطو سره سم د ریورس لیږد لپاره تصادفي پرائمرونه، اولیګو dT یا د جین ځانګړي پریمرونه غوره کړئ:
(1) ځانګړي نقلونه: د جین ځانګړي پریمر سپارښتنه کیږي؛
(2) اوږده ټوټه نقلونهOligo dT/جین ځانګړي پرائمر سپارښتنه کیږي؛
(3) د اوږدې برخې لیږد داخلي ټوټې: د جین ځانګړي پرائمرونه / تصادفي پریمرونه / تصادفي پریمر + اولیګو dT.که د qPCR راتلونکی تجربه ترسره شي، Oligo dT یوازې نشي کارول کیدی، ځکه چې یوازې د Oligo dT کارول کیدای شي د 3′ پای تعصب لامل شي، چې د qPCR تجربې غلطې پایلې لامل کیږي؛
(4) miRNA: د ډډ لوپ پرائمر یا د ټیلینګ پریمر کارول کیدی شي.

څو ځله باید د متقابل لیږد محصول cDNA د مقدار کولو لپاره ضعیف شي؟
د ریورس ټرانسکرپشن محصول د cDNA ترلاسه کولو وروسته، د qPCR تجربو لپاره څو ځله cDNA باید کم شي خورا مهم دی.که چیرې د cDNA غلظت ډیر لوړ یا ډیر ټیټ وي، د پراخولو موثریت ممکن اغیزمن شي.آیا د cDNA غلظت اندازه کیدی شي، او دا باید څنګه ترسره شي؟
(1) د ریورس ټرانسکرپشن محصول د cDNA غلظت نشي اندازه کیدی، ځکه چې د cDNA محصول سربیره، د برعکس لیږد محصول هم د ریورس ټرانسکرپشن پاتې بفر، ریورس ټرانسکریپټیس، پریمر، او نور لري، چې د غلظت اندازه کولو پایلو سره مداخله کوي او له همدې امله OD260/280، OD260/280 او abDNA236 ریښتیا منعکس کوي. حاصلپه دې وخت کې ځینې ملګري به ووایي چې زه به له پاکوالي وروسته غلظت اندازه کړم؛دلته، Forgene غواړم یادونه وکړم چې د cDNA د پاکولو سپارښتنه نه کیږي، ځکه چې د بیرته راګرځیدو په واسطه ترلاسه شوي cDNA اوږدوالی توپیر لري، او لنډ cDNA به په پاکولو کې له لاسه ورکړي.
(۲) نو څه وکړي؟د qPCR تجربې دمخه، د cDNA د کمولو درجه د مخکې تجربې له لارې ټاکل کیدی شي.د مثال په توګه: د QPCR تجربو لپاره د نمونې په توګه د cDNA سټاک محلول، 10-fold dilution، او 100-fold dilution وکاروئ، او د 18-28 په حد کې د CT ارزښت سره د کمولو فکتور غوره کړئ.

miRNAs باید څنګه بیرته نقل شي؟
miRNA یو واحد ځړیدلی کوچنی مالیکول RNA دی چې شاوخوا 22 nt اندازه لري چې د پروټین لپاره کوډ نه کوي.د دې د لنډ اوږدوالي له امله، دودیز qPCR طریقه ستونزمنه ده چې په مستقیم ډول یې اندازه کړي، نو ډیری وختونه د miRNA پراخول اړین دي؛د miRNA لپاره په عام ډول کارول شوي ریورس ټرانسکرپشن میتودونه د سټیم لوپ میتود او د پای کولو میتود شامل دي.
د سټیم لوپ میتود د سټیم لوپ پریمرونو په اضافه کولو سره د miRNA پراخول دي.دا د کشف میتود لوړ حساسیت او ځانګړتیا لري، مګر د کشف کولو وسیله ټیټه ده.یو ریورس لیږد کولی شي یوازې یو miRNA او داخلي حواله کشف کړي.د tail-adding طريقه له دوو څخه جوړه شوې ده چې د دوو انزايمونو د ګډ عمل په واسطه بشپړيږي، کوم چې پولي اې پوليميريز او ریورس ټرانسکريپېز دي.PolyA پولیمیریز د پولیA tails اضافه کولو مسولیت په غاړه لري ترڅو miRNA ته اوږدوالی زیات کړي، او ریورس ټرانسکریپټیس د ریورس لیږد عکس العمل ترسره کوي.دا طریقه د لوړ کشف کولو وسیله لري او کولی شي څو miRNAs او داخلي حوالې په یو ریورس لیږد کې کشف کړي، مګر د سټیم لوپ میتود کې حساسیت او ځانګړتیا ټیټه ده.