PCR, څو PCR, د PCR په حالت کې, د PCR برعکس, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

موږ به د مختلف PCR مفکورې، مرحلې او توضیحات ترتیب کړو

Ⅰ. PCR

د پولیمریز چین عکس العمل چې د PCR په نوم یادیږي، یو مالیکول بیولوژیکي ټیکنالوژي ده چې د ځانګړو DNA ټوټې پراخولو لپاره کارول کیږي.دا په ویټرو کې د ځانګړي DNA نقل په توګه پیژندل کیدی شي.DNA پولیمیریز (DNA Polymerase I) په 1955 کې کشف شو، او د E. Coli Klenow ټوټه چې تجربه لرونکی ارزښت او عملیتیا لري، د 1970s په لومړیو کې د ډاکټر ایچ کلینو لخوا کشف شو، مګر دا چې دا انزایم د تودوخې برداشت نه کوي، د تودوخې لوړه درجه نشي کولی د لوړ حرارت درجه د پولیمرجن تعامل سره سمون ونه کړي.هغه انزايمونه چې نن ورځ کارول کيږي (د تاق پوليميراز په نامه ياديږي)، په 1976 کې د ګرمو پسرلي باکتريوم Thermus aquaticus څخه جلا شوي. د هغې ځانګړتیا دا ده چې دا د لوړې تودوخې مقاومت کولی شي او یو مثالی انزایم دی، مګر دا د 1980 څخه وروسته په پراخه توګه کارول کیږي.د PCR د اصلي اصلي پروټوټایپ اصلي مفهوم د جین ترمیم او کاپي کولو ته ورته دی، کوم چې په 1971 کې د ډاکټر KJell Kleppe لخوا وړاندیز شوی و. هغه لومړی ساده او لنډ مهاله جین کاپي خپره کړه (د PCR د لومړي دوه دورې عکس العملونو سره ورته).PCR نن ورځ په 1983 کې د ډاکټر کیري بی مولیس لخوا رامینځته شوی. ډاکټر مولیس په هغه کال کې د PE شرکتونو ته خدمت وکړ، نو PE د PCR صنعت کې ځانګړی حیثیت لري.ډاکټر موليس په رسمي ډول د ساکي او نورو سره په 1985 کې لومړۍ اړونده مقاله خپره کړه. له هغه وخت راهیسې د PCR کارول په ورځ کې زرګونه میله دي، او د اړوندو کاغذونو کیفیت ویل کیدی شي چې د څیړنې ډیری نور میتودونه بې خونده کوي.په تعقیب ، د PCR ټیکنالوژي په پراخه کچه په بیولوژیکي ساینسي څیړنو او کلینیکي غوښتنلیکونو کې کارول کیږي ، چې د مالیکول بیولوژي څیړنې خورا مهم ټیکنالوژي کیږي.مولیس د کیمیا په برخه کې د 1993 نوبل جایزه هم وګټله.

PCRاصول

د PCR ټیکنالوژۍ بنسټیز اصول د DNA طبیعي تکثیر پروسې ته ورته دی، او د هغې ځانګړتیا د oligonucleotide پرائمر پورې اړه لري چې د هدف ترتیب دواړو سرونو ته بشپړوي.PCR د انحطاط-اینالینګ - پراخولو له دریو بنسټیزو عکس العملونو څخه جوړ شوی دی: ①د ډي این اې د سانچې انحطاط: وروسته له دې چې د ټیمپلیټ DNA د یوې ټاکلې مودې لپاره شاوخوا 93 درجې سانتي ګراد ته تودوخه شي، د دوه اړخیز DNA محلول د PCR د پی سی آر امپلیفیکیشن لخوا رامینځته شوی چې د ټیمپلیټ لپاره د یو واحد DNA سره چمتو کیدی شي. بل پړاو غبرګون.②د ډي این اې او پرائمر د کینډۍ annealing (مرکب): وروسته له دې چې DNA تودوخه شي او په یوه سلسله کې تخریب شي، د تودوخې درجه شاوخوا 55 درجو ته راښکته کیږي.د پریمر بشپړونکي ترتیب او د ټیمپلیټ DNA واحد سلسله.③ د پریمر غزول: د DNA ټیمپلیټ - د پریمر پابند د TaqDNA پولیمیریز عمل پراساس دی، د dNTP سره د عکس العمل خام مواد په توګه.د نقل کولو اصول وساتئ، د نوي نیمه خوندي کاپي سلسله ترکیب کړئ چې د ټیمپلیټ DNA سلسله بشپړوي، او د سایکل انحطاط-اینالینګ - توسیع درې پروسې تکرار کولی شي ډیر "نیم ریزرو کاپي سلسله" ترلاسه کړي، او دا نوې سلسله بیا د راتلونکي دورې لپاره یو ټیمپلیټ شي.د لوپ بشپړولو لپاره 2-4 دقیقې وخت نیسي، هدف جین په 2-3 ساعتونو کې څو ملیونه ځله پراخ کیدی شي.

معیاريPCRد غبرګون سیسټم

د PCR عکس العمل پنځه عناصر

د PCR په عکس العمل کې په عمده توګه پنځه ډوله مادې دخیل دي ، د بیلګې په توګه پریمر ، انزایم ، dNTP ، ټیمپلیټ او بفر (Mg2+ اړین دی).[PCR کړنلاره]

د معیاري PCR پروسه په دریو مرحلو ویشل شوې ده

1. د DNA انحطاط (90°C-96°C): د تودوخې عمل الندې د DNA دوه ګوني زنځیرونه، د هایدروجن بانډونه ماتیږي، د واحد سلسلې DNA جوړوي.

2. annealing (25 ℃ -65 ℃): د سیسټم تودوخه کمه شوې، پریمر د DNA ټیمپلیټ سره یوځای کیږي ترڅو محلي ډبل چین جوړ کړي.

3. تمدید (70℃ -75℃): د Taq انزایم (شاوخوا 72°C، غوره فعالیت) د عمل لاندې، dNTP د خامو موادو په توګه کارول کیږي، د پریمر 5′ پای څخه 3′ پای ته غزول کیږي، ترکیب او ټیمپلیټ د یو بل د DNA سلسله تکمیلوي.

هره دوره د DNA مینځپانګه دوه چنده کوي ، منحل شوي ، انیل شوي او غزول کیږي.په اوس وخت کې، د لنډې امپلیفیکیشن ساحې له امله، ځینې PCR په ډیر لنډ وخت کې تکرار کیدی شي حتی که د Taq انزایم فعالیت غوره نه وي، نو دا په دوو مرحلو کې بدلیدلی شي، دا د انیل کولو او غزول په ورته وخت کې په 60°C-65°C کې ترسره کیدی شي.د پورته کولو او یخولو پروسې کمولو او د غبرګون سرعت ښه کولو لپاره.

د PCR عکس العمل ځانګړتیاوې

● لوړ ځانګړتیا

د PCR غبرګون ځانګړي پریکړه کونکي فکتورونه عبارت دي له: ① ​​د پریمر او ټیمپلیټ DNA ځانګړی ترکیب.②د بنسټ جوړونې اصول.③ د TaqDNA پولیمریز ترکیب غبرګون وفاداري.④د هدف جین ځانګړتیا او محافظه کارۍ.

د پریمرونو او ټیمپلیټونو سم ترکیب کلیدی دی.د پریمر او ټیمپلیټ پابند کول او د پریمر سلسلې غزول د الکلین بیس میچنګ اصول پراساس دي.د پولیمیریز ترکیب تعاملاتو وفاداري او د تاق DNA پولیمیریز د لوړې تودوخې مقاومت ترڅو په عکس العمل کې د ټیمپلیټ او پریمر پابند (مرکب) رامینځته کړي په لوړه تودوخه کې ترسره کیدی شي.د ترکیب ځانګړتیا خورا لوړه شوې.کلپ کولی شي د لوړې کچې درستیت وساتي.د لوړې محافظه کارۍ او لوړ محافظه کارۍ سره د هدف جینیکیک سیمې په ټاکلو سره، د هغې ځانګړتیا لوړه ده.

● لوړ حساسیت

د PCR محصولاتو تولید حجم د شاخص په واسطه لوړیږي ، کوم چې کولی شي د پیل کونکي نمونه پراخه کړي (PG=10-12) ترڅو د مایکرو کنټرولر کچه د مایکروګرام (μg = -6) کچې ته لوړه کړي.د هدف حجرې د 1 ملیون حجرو څخه کشف کیدی شي؛د ویروسونو په کشف کې، د PCR حساسیت کولی شي 3 RFUs ته ورسیږي (خالي ځایونه جوړ شوي واحدونه)؛د باکتریا په ساینس کې لږترلږه د کشف کچه 3 باکتریا ده.

● ساده او چټک

د PCR انعکاس د لوړ تودوخې ټیک DNA پولیمیریز کاروي ، کوم چې په یو وخت کې د عکس العمل حل اضافه کوي ، دا د DNA امپلیفیکیشن محلول او د اوبو حمام کڅوړه کې د تخریب - انیل - توسیع عکس العمل دی.عموما، د امپلیفیکیشن غبرګون د 2 څخه تر 4 ساعتونو کې بشپړیږي.وده شوي محصولات عموما د بریښنایی تلوار لخوا تحلیل کیږي ، او د آاسوټوپونو کارولو ته اړتیا نلري ، نه راډیو اکټیو ککړتیا ، او اسانه ترویج.

● د نمونې پاکوالی ټیټ دی

د ویروس یا باکتریا او کلتور حجرو جلا کولو ته اړتیا نشته.د DNA خام محصولات او RNA د امپلیفیر په توګه کارول کیدی شي.د DNA امپلیفیکیشن کشف په مستقیم ډول د کلینیکي نمونو په کارولو سره کارول کیدی شي لکه وینه ، د بدن مایع ، د ټوخي مینځلو مایع ، ویښتان ، حجرې او د ژوندی نسج.

PCRعام ستونزې

● غلط منفي، نه پراخ شوي بانډونه

د PCR غبرګون مهمې مرحلې عبارت دي له: ① ​​د ټیمپلیټ نیوکلیک اسیدونو چمتو کول، ② کیفیت او د پرائمر ځانګړتیا، ③ د انزایمونو کیفیت ④ د PCR دورې شرایط.د علت موندلو لپاره هم باید د پورتنیو لینکونو تحلیل او مطالعه وشي.

کينډۍ: ① کينډۍ متفرقه پروتين لري، ② کينډۍ کې د Taq انزايم انابيټر شامل دي، ③ په کينډۍ کې پروتين له منځه نه ځي، په ځانګړې توګه په کروموزوم کې د ګروپ پروتين.⑤ د ډیمینر نیوکلیک اسید تخریب بشپړ نه دی.کله چې د انزایمونو او پریمر کیفیت ښه وي، د امپلیفیکیشن بانډ شتون نلري، کوم چې ډیری احتمال د نمونو د هضم درملنه ده.د نیوکلیک اسید استخراج پروسې کې یو څه غلط دی، نو د مؤثره او مستحکم هضم حل چمتو کولو لپاره، د هغې کړنالره باید سمه شي او په خپلسري ډول بدل نشي.

د انزایمونو غیر فعال کول: یو نوی انزایم یا دواړه زاړه او نوي انزایمونه باید په ګډه وکارول شي ترڅو تحلیل شي چې ایا د انزایم فعالیت ورک شوی یا ناکافي دی چې د غلط منفي لامل کیږي.دا باید په پام کې ونیول شي چې د تاق انزایم یا ایتیدیم برومایډ ځینې وختونه هیر شوي.

پریمر: د پریمر کیفیت، د پریمر غلظت، او ایا د دوه پرائمر غلظت همغږي دی.دا د PCR د ناکامۍ یو عام دلیل دی یا د مخ په زیاتیدونکي بانډ مثالی نه دی او د خپریدو احتمال لري.د ځینو بستو شمیرو د پرائمر کیفیت سره ستونزې شتون لري.دوه پرائمرونه لوړ غلظت او ټیټ غلظت لري چې د ټیټ موثریت غیر متناسب امپلیفیکیشن لامل کیږي.د مخنیوي تدابیر دا دي: ① د واحدونو ترکیب کولو لپاره یو ښه پریمر غوره کړئ.② د پریمر غلظت نه یوازې د OD ارزښت پورې اړه لري ، بلکه د اګر شوګر جیل الیکٹروفورسیس رامینځته کولو لپاره د پریمر اصلي مایع ته هم پاملرنه کوي.دلته باید د پریمر پټې زون وي، او د دوو پرائمرونو روښانتیا باید په عمومي ډول سره وي.بیلټ، PCR ممکن پدې وخت کې ناکام شي، او دا باید د پریمر ترکیب واحد سره حل شي.که چیرې یو پریمر لوړ وي، روښانتیا ټیټه وي، او د هغې غلظت باید متوازن وي کله چې منحل شي.③ پریمر باید په لوړ غلظت کې تادیه شي او ذخیره شي ترڅو د یخچال د ډیری یخولو یا اوږدمهاله یخچالې برخې مخه ونیسي چې دا به د پریمر د خرابیدو او خرابیدو لامل شي.④ د پرائمر ډیزاین غیر معقول دی، لکه د پریمر اوږدوالی کافي نه دی، او ډی کلستر د پریمر ترمنځ جوړ شوی.

Mg2 + غلظت: د Mg2 + آیون غلظت د PCR امپلیفیکیشن موثریت باندې خورا لوی تاثیر لري.ډیر غلظت کولی شي د PCR امپلیفیکیشن مخالف جنس کم کړي.که چیرې غلظت خورا ټیټ وي ، د PCR امپلیفیکیشن محصول به حتی د توسیع بینډ پرته د PCR امپلیفیکیشن ناکامي رامینځته کړي.

د عکس العمل حجم بدلون: د PCR امپلیفیکیشن کې کارول شوي حجم 20ul، 30ul، او 50ul یا 100uL دی، د PCR امپلیفیکیشن لپاره د غوښتنلیک لوی حجم د ساینسي څیړنو او کلینیکي ازموینې د بیلابیلو موخو سره سم تنظیم شوی.د کوچنیو حجمونو لکه 20ul جوړولو وروسته، دا اړینه ده چې د اندازې جوړولو په وخت کې د کنډک حالت جوړ کړئ، که نه نو دا به ناکام شي.

فزیکي لاملونه: د PCR پراخولو لپاره بدلون خورا مهم دی.که چیرې د تودوخې درجه ټیټه وي، د انحراف وخت لنډ وي، دا احتمال لري چې په غلط منفي کې واقع شي؛د انیل کولو ډیر ټیټ حرارت کولی شي د غیر مشخص پراخوالي لامل شي او د ځانګړي امپلیفیکیشن موثریت کم کړي.د PCR امپلیفیکیشن موثریت کمولو لپاره د پریمرونو او ټیمپلیټونو ترکیب خورا ډیر تاثیر کوي.ځینې ​​​​وختونه دا اړینه ده چې معیاري ترمامیتر وکاروئ ترڅو د تودوخې بدلون ، انیل کولو او تودوخې تودوخه په تودوخې یا اوبو کې محلول ککر کې کشف کړئ ، کوم چې د PCR د ناکامۍ یو لامل دی.

د هدف ترتیب تغیرات: که چیرې د هدف ترتیب رامینځته شي ، تغیر یا حذف شي ، د پروټوټایپ او ټیمپلیټ ترکیب سره یوځای شي ، یا د هدف ترتیب نشتوالي له امله ، پریمر او ټیمپلیټ به بشپړونکي ترتیب له لاسه ورکړي ، او د دې PCR امپلیفیکیشن به بریالی نشي.

● غلط مثبت

د PCR امپلیفیکیشن بانډ د هدف ترتیب بانډ سره مطابقت لري ، او ځینې وختونه یې بانډ ډیر پاک او لوړ وي.

د پرائمر ډیزاین مناسب نه دی: ټاکل شوي امپلیفیکیشن سلسله او غیر مقصدي امپلیفیکیشن سلسله هوموولوژس لري ، نو کله چې د PCR امپلیفیکیشن وي ، د PCR پراخه شوي محصولات غیر هدف لرونکي ترتیبونه دي.د هدف ترتیب ډیر لنډ دی یا پریمر ډیر لنډ دی، او دا د غلط مثبت سره مخ دی.بیا ډیزاین ته اړتیا لري.

د هدف ترتیب یا امپلیفیکیشن محصولاتو کراس ککړتیا: د دې ککړتیا دوه لاملونه شتون لري: لومړی د ټول جینوم یا لویو برخو کراس ککړتیا چې د غلط مثبتو لامل کیږي.دا ډول غلط مثبت د لاندې میتودونو په واسطه حل کیدی شي: د عملیاتو په جریان کې محتاط او نرم اوسئ ترڅو د هدف ترتیب د نمونې ټوپک کې تنفس کولو یا د سینټرفیوګال ټیوب څخه بهر کیدو څخه مخنیوی وشي.پرته له انزایمونو او موادو څخه چې نشي کولی د لوړې تودوخې سره مقاومت وکړي ، ټول ریجنټ یا تجهیزات باید د لوړ فشار سره غیر منتن شي.سینټرفیوګال پایپونه او نمونې باید په یو وخت کې وکارول شي.کله چې اړتیا وي، د نمونو اضافه کولو دمخه، د عکس العمل ټیوب او ریجنټ د الټرا وایلیټ شعاعو سره مخ کیږي ترڅو موجوده نیوکلیک اسید له مینځه ویسي.دوهم، د هوا په ککړتیا کې کوچنۍ ټوټې.دا کوچنۍ ټوټې د هدف ترتیب څخه لنډې دي، مګر دوی یو مشخص هومولوژي لري.دا د یو بل سره ویشل کیدی شي.د پریمرونو بشپړولو وروسته ، د PCR محصول پراخ کیدی شي ، کوم چې به د غلط مثبت تولید لامل شي.دا د Nest PCR میتود کمولو یا له مینځه وړلو لپاره کارول کیدی شي.

● غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډ ښکاره کړئ

هغه بانډونه چې د PCR امپلیفیکیشن وروسته څرګند شوي د متوقع اندازې سره متناسب دي ، یا لوی یا کوچني ، یا په ورته وخت کې ، یا په ورته وخت کې ، ځانګړي امپلیفیکیشن بانډونه او غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه.د غیر مشخصو بانډونو راڅرګندیدل دا دي: لومړی، پرائمر د هدف ترتیب سره بشپړ بشپړونکي ندي، یا د پریمر پولیمرائزیشن د ډی کلستر جوړولو لپاره.دوهم دا چې د MG2 + ions غلظت خورا لوړ دی، د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه ده، او د PCR سایکلونو شمیر سره تړاو لري.دوهم، د انزایمونو کیفیت او مقدار.ډیری وختونه، د ځینو سرچینو انزایمونه غیر ځانګړي بانډونو ته زیان رسوي او د نورو سرچینو انزایمونه نه واقع کیږي.ځینې ​​​​وختونه د انزایمونو غیر مشخص پراخوالی هم پیښیږي.د مخنیوي تدابیر دا دي: د اړتیا په صورت کې د زړه راښکونکي بیا ډیزاین شوي.د انزایم مقدار کم کړئ یا د بلې سرچینې انزایم ځای په ځای کړئ.د ابتدايي مقدار کم کړئ، د ټیمپلیټ اندازه په مناسبه توګه زیاته کړئ، او د دورې شمیر کم کړئ.د انیل کولو تودوخه په سمه توګه لوړه کړئ یا د تودوخې دوه نقطې میتود وکاروئ (د 93 درجې انحطاط ، انیل کول او شاوخوا 65 درجې C پورې غزول).

● فلکي ټاو یا سمیر ټیپ ښکاره کړئ

د PCR امپلیفیکیشن ځینې وختونه داسې ښکاري چې پلي شوي یا مرمۍ یا د غالۍ په څیر بیلټ.د دې دلیل لپاره چې د انزایمونو ډیر مقدار یا د انزایمونو ضعیف کیفیت له امله ، د dNTP غلظت خورا لوړ دی ، د Mg2+ غلظت خورا لوړ دی ، د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه ده ، او د چکرونو شمیر خورا ډیر دی.د مخنیوي تدابیر دا دي: ① د انزایمونو مقدار کم کړئ، یا د بلې سرچینې انزایم بدل کړئ.②د dNTP غلظت کم کړئ ③په سمه توګه د Mg2+ غلظت کم کړئ.④ د ټیمپلیټ مقدار زیات کړئ او د چکرونو شمیر کم کړئ.

اړوند توليدات

PCR هیرووم (د رنګ سره)

◮ لوړ وفاداري: د عادي تاق انزایم په پرتله 6 ځله؛

◮ ګړندی پراخوالی سرعت

◮ نور ټیمپلیټ تطابق

◮ د لوړ ظرفیت لوړولو وړتیا

◮ د چاپیریال زغم پیاوړی دی: د یوې اونۍ لپاره په 37 ° C کې کیښودل شو، د 90٪ څخه ډیر فعالیت ساتل؛

◮ دا د 5'→ 3' DNA پولیمریز فعالیت او 5'→ 3' exonuclease فعالیت لري، پرته له 3'→ 5' exonuclease فعالیت.

د PCR آسانه (د رنګ سره)

د ځانګړي عکس العمل سیسټم او لوړ موثریت تاق DNA پولیمیریز د PCR عکس العمل د لوړ لوړولو موثریت ، ځانګړتیا او حساسیت رامینځته کوي.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (یو ګام)-SYBR شنه I

◮ یو ګام کټ په ورته ټیوب کې ریورس ټرانسکرپشن او qPCR دوه عکس العملونه رامینځته کوي ، یوازې RNA ، ځانګړي PCR پریمر او RNase-Free ddH اضافه کولو ته اړتیا لري₂O.

◮ کټ کولی شي په چټکه او مؤثره توګه د ویروس RNA تحلیل کړي یا RNA تعقیب کړي.

◮ دا کټ یو ځانګړی فورجین ریورس ټرانسکرپشن ریجنټ کاروي او د فورجین هوټ سټار ټیک DNA پولیمیریز د ځانګړي عکس العمل سیسټم سره یوځای د عکس العمل د لوړولو موثریت او ځانګړتیا ته په مؤثره توګه وده ورکوي.

◮ د عکس العمل مطلوب سیسټم د عکس العمل لوړ کشف حساسیت، قوي حرارتي ثبات، او غوره زغم لري.

◮ RT-qPCR اسانه^TM(یو ګام) - د SYBR شنه I کټ د ROX داخلي حوالې رنګ سره راځي، کوم چې د څاګانو تر مینځ د سیګنال شالید او سیګنال غلطیو له مینځه وړو لپاره کارول کیدی شي، کوم چې د پیرودونکو لپاره د کمیتي PCR وسیلو مختلف ماډلونو کې کارول اسانه دي.

RT اسانه^TMII (د ماسټر پریمکس لپاره د لومړي ځل لپاره د cDNA ترکیبد ریښتیني وخت PCR)

- د gDNA لرې کولو وړ وړتیا ، کوم چې کولی شي په 2 دقیقو کې په ټیمپلیټ کې gDNA لرې کړي.

- اغیزمن ریورس لیږد سیسټم، دا یوازې 15 دقیقې وخت نیسي ترڅو د لومړي سټینډ cDNA ترکیب بشپړ کړي.

- پیچلي ټیمپلیټونه: د لوړ GC مینځپانګې او پیچلي ثانوي جوړښت سره ټیمپلیټونه هم د لوړ موثریت سره بدلیدلی شي.

- د لوړ حساسیت ریورس ټرانسکرپشن سیسټم ، د pg کچې ټیمپلیټونه هم د لوړ کیفیت cDNA ترلاسه کولی شي.

- د ریورس لیږد سیسټم لوړ حرارتي ثبات لري، د غوره غبرګون تودوخه 42 ℃ ده، او دا لاهم په 50 ℃ کې د ریورس لیږد ښه فعالیت لري.