COVID-19 یوه ساري ناروغي ده چې د شدید حاد تنفسي سنډروم کورونویرس ډول 2 له امله رامینځته کیږي. کله چې یو څوک په ناروغۍ اخته کیږي ، ترټولو عام نښې یې تبه ، ټوخی او د ساه لنډۍ دي.

هغه نمونې چې د ازموینې لپاره کارول کیږي د nasopharyngeal swabs یا oropharyngeal swabs لخوا راټول کیدی شي.

PCR څه شی دی؟

د کورونویرس کشف معیاري میتود پولیمیریز چین عکس العمل ، PCR دی.دا یو میتود دی چې په پراخه کچه د مالیکول بیولوژي کې کارول کیږي.دا کولی شي په چټکۍ سره د ملیونونو څخه ملیاردونو ځانګړي DNA ټوټې کاپي کړي.

نوی کورونویرس خورا اوږد واحد ځړیدلی RNA جینوم لري.د دې لپاره چې دا ویروسونه د PCR لخوا کشف شي، د RNA مالیکولونه باید د دوی بشپړونکي DNA ترتیبونو کې د ریورس ټرانسکریپټیس په واسطه بدل شي، او بیا نوي ترکیب شوي DNA د معیاري PCR پروسیجرونو لخوا پراخ شي، کوم چې معمولا د RT-PCR په نوم پیژندل کیږي.

د RT-PCR پروسه

د RNA استخراج

د دې طریقې د ترسره کولو لپاره، ویروس RNA باید اساسا استخراج شي.د RNA پاکولو مختلف ډوله کټونه د اسانه ، ګړندي او مؤثره جلا کولو لپاره کارول کیدی شي.

د سوداګریز کټ په کارولو سره د ویروس RNA استخراج لپاره، لومړی نمونه په مایکرو سینټرفیوج ټیوب کې اضافه کړئ او بیا یې د لیسز بفر سره مخلوط کړئ.دا بفر په لوړه کچه منحل شوی او معمولا د فینول او ګیانیډین اسوتیوسیانیټ څخه جوړ دی.سربیره پردې، د RNase مخنیوی کونکي معمولا د لیسز بفر کې شتون لري ترڅو د دوامداره ویروس RNA جلا کول ډاډمن کړي.

د لیسز بفر د اضافه کولو وروسته، د نبض په واسطه د مخلوط کولو ټیوب وورټ کړئ او د خونې په حرارت درجه کې انکیوبیټ کړئ.وروسته بیا ویروس د لیسز بفر لخوا چمتو شوي خورا ډیر تخریب کونکي شرایطو لاندې لیس کیږي.

وروسته له دې چې نمونه لیز شي، د پاکولو پروسې لپاره د سینټرفیوج ټیوب کارول کیږي.نمونه په سینټرفیوج ټیوب کې بار کیږي او بیا سینټرفیوج کیږي.

دا کړنلاره د جامد پړاو استخراج میتود دی چې په کې سټیشنري مرحله د سیلیکا جیل میټرکس څخه جوړه ده.

د غوره مالګې او pH شرایطو لاندې، د RNA مالیکولونه د سیلیکا جھلی سره تړل کیږي.

په ورته وخت کې، پروټین او نور ککړتیاوې لرې کیږي.

د سینټرفیوګیشن وروسته، د سینټرفیوج ټیوب په پاکو راټولولو ټیوب کې واچوئ، فلټریټ پریږدئ، او بیا د مینځلو بفر اضافه کړئ.

ټیوب بیا په سینټرفیوج کې ځای په ځای کړئ ترڅو د غشا له لارې د مینځلو بفر مجبور کړي.دا به د غشا څخه ټول پاتې ناپاکۍ لرې کړي، یوازې RNA د سیلیکا جیل پورې تړلی پاتې کیږي.

وروسته له دې چې نمونه ومینځل شي، ټیوب په پاک مایکرو سینټرفیوج ټیوب کې واچوئ او د ایلیوشن بفر اضافه کړئ.

بیا دا سینټرفیوج کیږي ترڅو د غشا له لارې د elution بفر په زور سره حرکت وکړي.د الیشن بفر د سپن کالم څخه ویروس RNA لرې کوي او پاک شوي RNA ترلاسه کوي چې د پروټینونو، مخنیوی کونکو او نورو ککړونکو موادو څخه پاک وي.

2 ګام

مخلوط غلظت

د ویروس RNA استخراج وروسته، بل ګام د PCR امپلیفیکیشن لپاره د عکس العمل مخلوط چمتو کول دي.پدې مرحله کې، تمرکز کارول کیږي.دا متمرکز محلول یو پریمکس شوی متمرکز محلول دی چې یو پریمکس، ریورس ټرانسکریټیس، نیوکلیوټایډز، فارورډ پریمر، ریورس پریمر، TaqMan probe او DNA پولیمریز لري.

په نهایت کې ، د دې عکس العمل مخلوط بشپړولو لپاره ، د RNA ټیمپلیټ اضافه شوی.ټیوبونه د نبض vortexing پواسطه مخلوط کیږي، او بیا د عکس العمل مخلوط د PCR پلیټ کې بار کیږي.د PCR پلیټ معمولا 96 څاګانې لري او کولی شي په ورته وخت کې ډیری نمونې تحلیل کړي.

درېیم ګام

د PCR پراخول

بیا، پلیټ د PCR ماشین کې ځای په ځای کړئ، کوم چې په اصل کې د تودوخې سایکلر دی.

د ریښتیني وخت RT-PCR د RdrRP جین ، E جین او N جین کې د هدف ترتیب پراخه کولو سره د 2019 ناول کورونویرس کشف کولو لپاره کارول کیږي.د هدف جین انتخاب د پریمر او تحقیقاتو ترتیب پورې اړه لري.

د RT-PCR لومړی ګام ریورس لیږد دی.د بشپړونکي DNA لومړی ډنډ ترکیب شوی ، کوم چې د PCR ریورس پریمر لخوا پیل شوی ، کوم چې د ویروس RNA جینوم بشپړونکي برخې سره تړاو لري.بیا ریورس ټرانسکریټیس د DNA نیوکلیوټایډونه د پریمر په 3 پای کې اضافه کوي ترڅو د ویروس RNA تکمیلي DNA ترکیب کړي.د دې مرحلې تودوخې او موده د پرائمرونو، هدف RNA، او کارول شوي ریورس ټرانسکریټس پورې اړه لري.

بیا، د ابتدايي تخریب مرحله پلي کیږي، کوم چې د RNA-DNA هایبرډ د ویجاړیدو پایله لري.دا ګام د DNA پولیمریز فعالولو لپاره اړین دی.په ورته وخت کې، ریورس ټرانسکریټ غیر فعال دی.

PCR د حرارتي دورې لړۍ څخه جوړه ده.هر دوره د ډینیټوریشن، اینیلینګ او توسیع مرحلو څخه جوړه ده.

د ډینیټوریشن مرحله کې د عکس العمل خونه د 95 درجې سانتي ګراد تودوخه کول او د دوه ګوني ډنډ شوي DNA ټیمپلیټ د تخریب لپاره کارول شامل دي.

په بل ګام کې، د عکس العمل تودوخه 58 درجې سانتي ګراد ته راټیټه شوې، چې مخکینۍ پریمر ته اجازه ورکوي چې د خپل واحد ډنډ شوي DNA ټیمپلیټ بشپړونکي برخې ته انیل کړي.د انیل کولو تودوخه مستقیم د پریمر په اوږدوالي او جوړښت پورې اړه لري.

د تمدید په مرحله کې، د DNA پولیمریز یو نوی DNA سټینډ ترکیب کوي چې د DNA ټیمپلیټ سټینډ سره تکمیل کوي.د تعامل له مخلوط څخه د 5′تر 3′هدف کې کېنډۍ ته د وړیا نیوکلی بشپړونکي اضافه کولو سره.د دې مرحلې تودوخه د DNA پولیمیریز کارول پورې اړه لري.

د لومړي دورې وروسته، د دوه اړخیزه DNA هدف ترلاسه کیږي.

بیا، دویم پړاو ته ننوځئ.دوه اړخیزه DNA د دوه واحد ډنډ شوي DNA مالیکولونو تولید لپاره رد شوی.

په بل ګام کې، د عکس العمل تودوخه ټیټه شوې، پرائمرونه د هر واحد ډنډ شوي DNA ټیمپلیټ سره نښلول کیږي، او د Taq-man تحقیقات د هدف DNA بشپړونکي برخې سره نښلول کیږي.

د TaqMan پروب د فلوروفور څخه جوړ دی چې د اولیګونیوکلیوټایډ تحقیقاتو 5 پای سره تړاو لري.کله چې د سایکلر د رڼا سرچینې لخوا په زړه پورې وي، فلوروفور فلوروسینس جذبوي.برسېره پردې، تحقیقات د 3′ پای کې د quencher څخه جوړ شوی دی.quencher ته د راپور ورکوونکي جین نږدېوالی د فلوروسینس د کشف مخه نیسي.

د تمدید په مرحله کې، د DNA پولیمریز یو نوی سټینډ ترکیب کوي.کله چې پولیمیریز د TaqMan تحقیقاتو ته ورسیږي، د هغې د پایښت 5′نیوکلیز فعالیت تحقیقات پاکوي، رنګ له قویونکي څخه جلا کوي.

د PCR د هرې دورې سره، ډیر رنګ مالیکولونه خوشې کیږي، چې په پایله کې د فلوروسینس شدت د ترکیب شوي امپلیکونونو شمیر سره متناسب زیاتوالی دی.

دا میتود تاسو ته اجازه ورکوي چې په نمونه کې د ورکړل شوي ترتیب شمیر اټکل کړي.په هر دور کې د ډبل سټنډ شوي DNA ټوټو شمیر دوه چنده کیږي.نو ځکه، PCR د ډیرو کوچنیو نمونو تحلیل لپاره کارول کیدی شي.

د فلوروسینټ سیګنال اندازه کولو لپاره ، ټنګسټن هالوجن څراغ ، د جوش فلټر ، انعکاس کونکی ، لینز ، د اخراج فلټر او د چارج جوړه وسیله - د CCD کیمرې کارول.

مرحله 4 کشف کړئ

د فلوروسینټ سیګنال اندازه کولو لپاره ، ټنګسټن هالوجن څراغ ، د جوش فلټر ، انعکاس کونکی ، لینز ، د اخراج فلټر او د چارج جوړه وسیله - د CCD کیمرې کارول.

د څراغ څخه فلټر شوې رڼا د انعکاس کونکي لخوا منعکس کیږي، د کنډنسر لینز څخه تیریږي، او د هر سوري مرکز ته متمرکز کیږي.بیا د سوري څخه خارج شوی فلوروسینس د عکس څخه منعکس کیږي ، د اخراج فلټر څخه تیریږي ، او د CCD کیمرې لخوا کشف کیږي.د PCR په هر دور کې، د ځان په زړه پورې فلوروفور رڼا د CCD لخوا کشف کیدی شي.

دا نیول شوي رڼا په ډیجیټل ډیټا بدلوي.دا میتود د ریښتیني وخت PCR په نوم یادیږي ، او دا د PCR عکس العمل پرمختګ ریښتیني وخت څارنې ته اجازه ورکوي.