RT-qPCR د عادي PCR ټیکنالوژۍ څخه رامینځته شوی.دا د دودیز PCR عکس العمل سیسټم ته فلوروسینټ کیمیاوي توکي (فلوریسنټ رنګونه یا فلوروسینټ پروبونه) ​​اضافه کوي ، او د دوی مختلف لومینیسینټ میکانیزمونو سره سم په ریښتیني وخت کې د PCR انیل کولو او غزولو پروسه کشف کوي.په متوسطه کې د فلوروسینټ سیګنال بدلونونه د PCR په هر دور کې د محصول بدلون مقدار محاسبه کولو لپاره کارول کیږي.اوس مهال، ترټولو عام میتودونه د فلوروسینټ رنګ میتود او د تحقیقاتو میتود دی.

د فلوروسینټ رنګ کولو طریقه:
ځینې ​​فلوروسینټ رنګونه لکه SYBR شنه Ⅰ، PicoGreen، BEBO، او نور په خپله رڼا نه خپروي، مګر د dsDNA کوچنۍ نالی سره تړلو وروسته فلوروسینټ خارجوي.نو ځکه، د PCR غبرګون په پیل کې، ماشین نشي کولی د فلوروسینټ سیګنال کشف کړي.کله چې عکس العمل د annealing-extension (دوه مرحلې میتود) یا د تمدید مرحلې (درې مرحلې میتود) ته لاړ شي، په دې وخت کې دوه ګوني سټنډونه پرانستل کیږي، او د نوي DNA پولیمیریز د سټینډ ترکیب په جریان کې، فلوروسینټ مالیکولونه د dsDNA کوچني نالی کې سره یوځای کیږي او د فلوورینس خارجوي.لکه څنګه چې د PCR دورې شمیر ډیریږي ، ډیر او ډیر رنګونه د dsDNA سره یوځای کیږي ، او د فلوروسینټ سیګنال هم په دوامداره توګه وده کوي.د مثال په توګه د SYBR شنه Ⅰ واخلئ.
د تفتیش طریقه:
تاقمان پروب د هایدرولیسز تحقیقاتو ترټولو عام کارول کیږي.د تحقیقاتو په 5′ پای کې د فلوروسینټ ګروپ شتون لري، معمولا FAM.تحقیقات پخپله یو ترتیب دی چې د هدف جین بشپړونکی دی.د فلوروفور په 3′ پای کې د فلوروسینټ قندونکې ډله شتون لري.د فلوروسینټ ریزونانس انرژی لیږد د اصولو له مخې (Förster resonance energy transfer, FRET)، کله چې د ریپورټر فلوروسینټ ګروپ (ډونر فلوروسینټ مالیکول) او د شنډونکي فلوروسینټ ګروپ (د منلو وړ فلوروسینټ مالیکول) کله چې د جوش سپیکٹرم سره تیریږي او فاصله د excitation 1 کې ډیر نږدې کیدی شي. د منلو وړ مالیکول فلوروسینس، پداسې حال کې چې آٹو فلوروسینس کمزوری شوی.له همدې امله، د PCR غبرګون په پیل کې، کله چې تحقیقات په سیسټم کې وړیا او ثابت وي، د راپور ورکوونکي فلوروسینټ ګروپ به فلوروسینټ نه جذبوي.کله چې annealing کیږي، پریمر او پروب د ټیمپلیټ سره تړل کیږي.د تمدید مرحلې په جریان کې، پولیمیریز په دوامداره توګه نوي زنځیرونه ترکیب کوي.DNA پولیمریز 5′-3′ exonuclease فعالیت لري.کله چې تحقیقاتو ته ورسیږو، د DNA پولیمیریز به د ټیمپلیټ څخه تحقیقات هایډرولیز کړي، د ریپورټر فلوروسینټ ګروپ د قوینر فلوروسینټ ګروپ څخه جلا کړي، او د فلوروسینټ سیګنال خوشې کړي.څرنګه چې د تحقیقاتو او ټیمپلیټ ترمنځ یو له بل سره اړیکه شتون لري، د تحقیقاتو طریقه د ډای میتود څخه د ازموینې د دقت او حساسیت له مخې غوره ده.

شکل 1 د qRT-PCR اصول

د پریمر ډیزاین
اصول:

پرائمرونه باید د نیوکلیک اسید لړۍ په خوندي سیمه کې ډیزاین شي او ځانګړتیا ولري.

دا غوره ده چې د cDNA ترتیب وکاروئ، او د mRNA ترتیب هم د منلو وړ دی.که نه، د DNA ترتیب د cds سیمه ډیزاین ومومئ.
د فلوروسینټ کمیتي محصول اوږدوالی 80-150bp دی، تر ټولو اوږد 300bp دی، د پریمر اوږدوالی عموما د 17-25 بیسونو ترمنځ وي، او د پورته او ښکته پرائمر ترمنځ توپیر باید ډیر لوی نه وي.

د G+C منځپانګه د 40٪ او 60٪ ترمنځ ده، او 45-55٪ غوره ده.
د TM ارزښت د 58-62 درجو ترمنځ دی.
هڅه وکړئ د پریمر ډیمرونو او سیلف ډیمرونو څخه مخنیوی وکړئ ، (د پرله پسې تکمیلي اډو څخه له 4 جوړه څخه ډیر نه ښکاري) د ویښتانو جوړښت ، که چیرې ناباوره وي ، ΔG <4.5kJ/mol * جوړ کړئ * که تاسو ډاډه نه شئ چې gDNA د ریورس لیږد پرمهال پاک شوی وي ، نو غوره به وي چې د انټرون پریمر ډیزاین کړئ ، د GAT موډ څخه مخنیوی وکړئ ، د GAT 3 څخه مخنیوی نشي کولی. /C، A/G دوامداره جوړښت (2-3) پریمر او غیر
د متفاوت ډول پراخ شوي ترتیب هومولوژي په غوره توګه د 70٪ څخه کم وي یا 8 بشپړونکي اساس هومولوژي لري.
ډیټابیس:
د کلیدي کلمو په واسطه د CottonFGD لټون
د پریمر ډیزاین:
د IDT-qPCR پریمر ډیزاین

Fig2 IDT آنلاین پریمر ډیزاین وسیلې پاڼه

د انځور 3 پایلې پاڼې ښودل
د lncRNA پرائمر ډیزاین:
lncRNA:د mRNA په څیر ورته ګامونه.
miRNA:د سټیم لوپ میتود اصول: څرنګه چې ټول miRNAs د 23 nt لنډ ترتیبونه دي، مستقیم PCR کشف نشي ترسره کیدی، نو د سټیم لوپ ترتیب وسیله کارول کیږي.د سټیم لوپ ترتیب تقریبا 50 nt یو واحد ډنډ شوی DNA دی چې کولی شي پخپله د ویښتو جوړښت رامینځته کړي.3 پای د miRNA جزوی ټوټې لپاره د بشپړونکي ترتیب په توګه ډیزاین کیدی شي، بیا د هدف miRNA د ریورس لیږد په جریان کې د سټیم لوپ ترتیب سره وصل کیدی شي، او ټول اوږدوالی 70bp ته رسیدلی شي، کوم چې د qPCR لخوا ټاکل شوي پراخ شوي محصول اوږدوالی سره سمون لري.د ټایلنګ miRNA پریمر ډیزاین
د پراخوالي مشخص کشف:
د آنلاین چاودنې ډیټابیس: CottonFGD چاودنه د ترتیب ورته والی له مخې
ځایی چاودنه: د ځایی چاودنې کولو لپاره د Blast+ کارولو ته مراجعه وکړئ، لینکس او ماکوس کولی شي مستقیم یو محلي ډیټابیس رامینځته کړي، د Win10 سیسټم د اوبنټو باش نصبولو وروسته هم ترسره کیدی شي.د ځایی چاودنې ډیټابیس او ځایی چاودنې رامینځته کړئ؛په Win10 کې اوبنټو باش خلاص کړئ.
نوټ: د ځمکې لاندې پنبه او د سمندري ټاپو پنبه د تیټراپلایډ فصلونه دي، نو د چاودنې پایله به اکثرا دوه یا ډیر میچونه وي.په تیرو وختونو کې، د چاودنې ترسره کولو لپاره د ډیټابیس په توګه د NAU cds کارول احتمال لري چې یوازې د څو SNP توپیرونو سره دوه هوموولوژس جینونه ومومي.عموما، دوه هوموولوژس جینونه د پریمر ډیزاین لخوا نه جلا کیدی شي، نو دوی ورته ورته چلند کیږي.که چیرې ښکاره انډیل شتون ولري، پریمر معمولا په انډیل کې ډیزاین شوی، مګر دا کیدای شي د پریمر ثانوي جوړښت لامل شي، وړیا انرژي لوړه کیږي، چې د امپلیفیکیشن موثریت کې کمښت المل کیږي، مګر دا ناباوره ده.

د لومړني ثانوي جوړښت کشف:
ګامونه:خلاص اولیګو 7 → د انپټ ټیمپلیټ ترتیب → فرعي کړکۍ بند کړئ → خوندي کړئ → په ټیمپلیټ کې پریمر ومومئ ، د پریمر اوږدوالي ټاکلو لپاره ctrl + D فشار ورکړئ → مختلف ثانوي جوړښتونه تحلیل کړئ ، لکه د سیلف ډیمیرائزیشن باډي ، هیټروډیمر ، ویښتان ، بې اتفاقي او داسې نور. وروستي دوه عکسونه د لومړني ازموینې پایلې په شکل کې دي.د مخکینۍ پریمر پایله ښه ده، هیڅ ښکاره ډیمر او د ویښتو جوړښت شتون نلري، د دوامداره بشپړونکي اډې شتون نلري، او د وړیا انرژی مطلق ارزښت له 4.5 څخه کم دی، پداسې حال کې چې شاته پریمر ثابت ښیي چې د 6 اډې بشپړونکي دي، او وړیا انرژي 8.8 ده؛برسېره پردې، یو ډیر جدي ډیمر د 3′ پای کې ښکاري، او د 4 پرله پسې اډو یو ډیمر ښکاري.که څه هم وړیا انرژي لوړه نه ده، د 3′ dimer Chl کولی شي په جدي توګه د امپلیفیکیشن ځانګړتیا او د لوړولو موثریت اغیزمن کړي.برسېره پردې، دا اړینه ده چې د ویښتو رنګونو، هیټروډیمرونو، او بې توپیرونو لپاره وګورئ.

انځور 3 oligo7 کشف پایلې
د پراخوالي موثریت کشف:
د PCR عکس العمل پراخولو موثریت د PCR پایلو باندې جدي اغیزه کوي.همدارنګه په qRT-PCR کې، د پراخولو موثریت په ځانګړې توګه د کمیتي پایلو لپاره مهم دی.د عکس العمل بفر کې نور توکي، ماشینونه او پروتوکولونه لرې کړئ.د پریمر کیفیت هم د qRT-PCR د لوړولو موثریت باندې لوی تاثیر لري.د دې لپاره چې د پایلو دقت یقیني شي، دواړه د اړونده فلوروسینس مقدار او د مطلق فلوروسینس مقدار کولو ته اړتیا لري ترڅو د پریمرونو د لوړولو موثریت کشف کړي.دا پیژندل شوی چې د qRT-PCR د تطبیق موثریت د 85٪ او 115٪ ترمنځ دی.دوه میتودونه شتون لري:
1. معیاري منحنی طریقه:
a.د cDNA مخلوط کړئ
ب.تدریجي تحلیل
c.qPCR
d.د لاین ریګریشن معادلې د امپلیفیکیشن موثریت محاسبه کولو لپاره
2. LinRegPCR
LinRegPCR د ریښتیني وخت RT-PCR ډیټا تحلیل لپاره یو برنامه ده ، چې د SYBR شنه یا ورته کیمیا پراساس کمیتي PCR (qPCR) ډیټا هم ویل کیږي.برنامه غیر اساسی اصالح شوي ډیټا کاروي ، په هر نمونه کې په جلا توګه اساسی اصالحات ترسره کوي ، د کړکۍ خطي ټاکي او بیا د PCR ډیټا سیټ له لارې مستقیم کرښه فټ کولو لپاره د خطي ریګریشن تحلیل کاروي.د دې لین له سلیپ څخه د هر انفرادي نمونې د PCR موثریت محاسبه کیږي.په هر نمونه کې د PCR اوسط موثریت او په هر نمونه کې د Ct ارزښت د هرې نمونې د پیل غلظت محاسبه کولو لپاره کارول کیږي چې په خپلسري فلوروسینس واحدونو کې څرګند شوي.د ډیټا داخلول او محصول د ایکسل سپریډ شیټ له لارې دي.یوازې نمونه
مخلوط ته اړتیا ده، نه تدریجي
ګامونه اړین دي:(د مثال په توګه بول CFX96 واخلئ، د روښانه ABI سره ماشین نه دی)
تجربه:دا یو معیاري qPCR تجربه ده.
د qPCR ډیټا محصول:LinRegPCR کولی شي د محصول فایلونو دوه ډولونه وپیژني: RDML یا د مقدار ورکولو امپلیفیکیشن پایله.په حقیقت کې ، دا د ماشین لخوا د دورې شمیرې او فلوروسینس سیګنال ریښتیني وخت کشف ارزښت دی ، او امپلیفیکیشن د خطي برخې موثریت د فلوروسینس بدلون ارزښت تحلیل کولو سره ترلاسه کیږي.
د معلوماتو انتخاب: په تیوري کې، د RDML ارزښت باید د کارولو وړ وي.اټکل کیږي چې زما د کمپیوټر ستونزه دا ده چې سافټویر نشي کولی RDML وپیژني، نو زه د اصلي معلوماتو په توګه د ایکسل محصول ارزښت لرم.دا سپارښتنه کیږي چې لومړی د ډیټا دقیق سکرینینګ ترسره کړئ ، لکه د نمونو اضافه کولو کې ناکامي ، او داسې نور. ټکي د محصول ډیټا کې حذف کیدی شي (البته ، تاسو نشئ کولی دوی حذف کړئ ، LinRegPCR به په وروستي مرحله کې دا ټکي له پامه غورځوي)

شکل 5 qPCR ډیټا صادرول

انځور 6 د کاندید نمونو انتخاب

د معلوماتو داخلول:خلاص قابلیت amplification results.xls، → خلاص LinRegPCR → فایل → له ایکسل څخه لوستل → پیرامیټرونه غوره کړئ لکه څنګه چې په 7 شکل کې ښودل شوي → OK → اساسات مشخص کړئ کلیک وکړئ

د linRegPCR ډیټا داخلولو انځور 7 مرحلې

پایله:که چیرې تکرار نه وي، هیڅ ګروپ ته اړتیا نشته.که چیرې تکرار شتون ولري، د نمونې ګروپ کولو کې ګروپي کول ترمیم کیدی شي، او د جین نوم په پیژندونکي کې داخلیږي، او بیا ورته جین به په اتوماتيک ډول ګروپ شي.په نهایت کې ، په فایل کلیک وکړئ ، ایکسل صادر کړئ او پایلې وګورئ.د هر څاه د لوړولو موثریت او R2 پایلې به ښودل شي.دوهم، که تاسو په ګروپونو ویشئ، د اصلاح شوي اوسط پراخولو موثریت به ښکاره شي.ډاډ ترلاسه کړئ چې د هر پریمر د لوړولو موثریت د 85٪ او 115٪ ترمنځ دی.که دا ډیر لوی یا ډیر کوچنی وي، دا پدې مانا ده چې د پریمر د پراخولو موثریت ضعیف دی.

شکل 8 پایله او د معلوماتو محصول

تجربه پروسه:
د RNA کیفیت اړتیاوې:
پاکوالی:1.72.0 ښیي چې ممکن پاتې اسوتیوسیانیټ شتون ولري.کلین نیوکلیک اسید A260/A230 باید د 2 په شاوخوا کې وي .که چیرې په 230 nm کې قوي جذب شتون ولري، دا په ګوته کوي چې عضوي مرکبات شتون لري لکه phenate ions.سربیره پردې ، دا د 1.5٪ agarose جیل الیکٹروفورسیس لخوا کشف کیدی شي.مارکر په نښه کړئ، ځکه چې ssRNA هیڅ تخریب نلري او د مالیکول وزن لوګاریتم خطي اړیکه نلري، او مالیکول وزن په سمه توګه نشي څرګندیدلی.تمرکز: په نظري توګهنهد 100ng/ul څخه کم، که غلظت ډیر ټیټ وي، پاکوالی عموما ټیټ وي نه لوړ وي

انځور 9 RNA جیل

برسېره پردې، که نمونه قیمتي وي او د RNA غلظت لوړ وي، نو سپارښتنه کیږي چې د استخراج وروسته یې الیکوټ کړئ، او RNA د 100-300ng/ul وروستي غلظت ته د بیرته راګرځولو لپاره کم کړئ.پهد بیرته لیږد پروسهکله چې mRNA نقل کیږي، oligo (dt) پرائمرونه چې کولی شي په ځانګړي ډول د پولیA tails سره وصل شي د ریورس لیږد لپاره کارول کیږي، پداسې حال کې چې lncRNA او circRNA د ټول RNA د ریورس لیږد لپاره تصادفي هیکسامر (Random 6 mer) پریمیرونه کاروي د miRNA لپاره، miRNA-ځانګړي ټرانسکرپشن پرائمرونو لپاره miRNA-ځانګړي ټرانسکرپشن پرائمر کارول کیږي.ډیری شرکتونو اوس د ټیلینګ ځانګړي کټونه په لاره اچولي دي.د سټیم لوپ میتود لپاره، د پایښت کولو طریقه خورا اسانه، د لوړې کچې له لارې، او د ریجنټ خوندي کول دي، مګر د ورته کورنۍ د miRNAs توپیر کولو اغیز باید د سټیم لوپ میتود په څیر ښه نه وي.هر ریورس ټرانسکرپشن کټ د جین ځانګړي پریمرونو (ډډ لوپس) غلظت لپاره اړتیاوې لري.داخلي حواله چې د miRNA لپاره کارول کیږي U6 دی.د سټیم لوپ انډول کولو په پروسه کې، د U6 یو ټیوب باید په جلا توګه بدل شي، او د U6 مخکینۍ او شاته پریمرونه باید مستقیم اضافه شي.دواړه circRNA او lncRNA کولی شي HKGs د داخلي حوالې په توګه وکاروي.پهد cDNA کشف،
که د RNA سره کومه ستونزه ونلري، cDNA هم باید ښه وي.که څه هم، که د تجربې بشپړتیا تعقیب شي، نو دا به غوره وي چې د داخلي حوالې جین (ریفرنس جین، RG) وکاروئ کوم چې کولی شي gDNA له cds سره توپیر وکړي.په عموم کې، RG د کور ساتلو جین دی., HKG) لکه څنګه چې په 10 شکل کې ښودل شوي؛په هغه وخت کې، ما د سویا بین ذخیره کولو پروټین جوړ کړ، او د داخلي حوالې په توګه د انټروون درلودونکي actin7 کارول.په gDNA کې د دې پریمر د پراخې شوې ټوټې اندازه 452bp وه، او که cDNA د ټیمپلیټ په توګه وکارول شي، دا 142bp وه.بیا د ازموینې پایلو وموندله چې د cDNA برخه په حقیقت کې د gDNA لخوا ککړه وه، او دا هم ثابته شوه چې د ریورس لیږد په پایله کې کومه ستونزه شتون نلري، او دا د PCR لپاره د نمونې په توګه کارول کیدی شي.دا بې ګټې ده چې د agarose gel electrophoresis په مستقیم ډول د cDNA سره چل کړئ، او دا یو توزیع بانډ دی، کوم چې قانع نه دی.

انځور 10 د cDNA کشف

د qPCR شرایطو ټاکلعموما د کټ پروتوکول مطابق کومه ستونزه نده، په عمده توګه د tm ارزښت په مرحله کې.که چیرې ځینې پریمرونه د پریمر ډیزاین په جریان کې په ښه توګه ډیزاین شوي نه وي، په پایله کې د tm ارزښت او نظریاتي 60 ° C ترمنځ لوی توپیر رامنځته کیږي، دا سپارښتنه کیږي چې د cDNA نمونې مخلوط شي، د پریمرونو سره یو تدریجي PCR چل کړئ، او هڅه وکړئ چې د TM ارزښت په توګه د بډونو پرته د تودوخې ترتیب کولو څخه ډډه وکړئ.

د معلوماتو تحلیل

د دودیز نسبي فلوروسینس مقداري PCR پروسس کولو میتود اساسا د 2 مطابق دی-ΔΔCT.د معلوماتو پروسس کولو ټیمپلیټ.

اړوند توليدات:

د ریښتیني وخت PCR اسانه^TM -تقمان

د ریښتیني وخت PCR اسانه^TM – سایبر ګرین I

RT ایزی I (د لومړي سټینډ cDNA ترکیب لپاره ماسټر پریمکس)

RT ایزی II (د qPCR لپاره د لومړي سټینډ cDNA ترکیب لپاره ماسټر پریمکس)