په لابراتوار کې د نوي په توګه، دا ښه کار نه دی چې د بوټو له یوې ډلې څخه مثبت نباتات د ټیټ تبادلې نرخ سره معاینه کړي.لومړی، DNA باید د ډیرو نمونو څخه یو له یو څخه ایستل شي، او بیا به بهرني جینونه د PCR لخوا کشف شي.په هرصورت، پایلې اکثرا کله ناکله د یو څو توکو سره خالي او بانډونه وي، مګر دا ناشونې ده چې معلومه کړي چې ایا ورک شوي کشف یا غلط کشفونه شتون لري..ايا له داسې تجربوي بهير او پايلو سره مخ کېدل ډېر بې وسه دي؟اندیښنه مه کوئ، ورور تاسو ته درس درکوي چې څنګه د ټرانسجینک مثبت بوټي په اسانۍ او دقیق ډول سکرین کړئ.

1 ګام

ډیزاین کشف پریمر

د ازمویل شوي نمونې سره سم کشف شوي endogenous جین او exogenous جین معلوم کړئ ، او د پریمر ډیزاین لپاره په جین کې د 100-500bp ترتیب نمایندګي غوره کړئ.ښه پرائمر کولی شي د کشف پایلو دقیقیت ډاډمن کړي او د کشف وخت لنډ کړي (په عام ډول د کشف پرائمرونو لپاره ضمیمه وګورئ).

نوټ: نوي ډیزاین شوي پرائمرونه باید د عکس العمل شرایط اصلاح کړي او د لوی کچې کشف کولو دمخه د کشف دقت ، دقیقیت او کشف حد تصدیق کړي.

2 ګام

د تجربې پروتوکول ډیزاین کړئ

مثبت کنټرول: د پاک شوي DNA څخه کار واخلئ چې د هدف ټوټې لري د یوې نمونې په توګه دا معلومه کړي چې ایا د PCR غبرګون سیسټم او شرایط نورمال دي.

منفي/خالي کنټرول: د DNA ټیمپلیټ یا ddH2O وکاروئ چې د هدف ټوټه د ټیمپلیټ په توګه نه لري ترڅو معلومه کړي چې ایا د PCR سیسټم کې د ککړتیا سرچینه شتون لري.

د داخلي حوالې کنټرول: د نمونې د اندروجینس جین د پریمر/تحقیقاتو ترکیب وکاروئ ترڅو دا ارزونه وکړي چې ایا دا نمونه د PCR لخوا کشف کیدی شي.

خبرتیا:

مثبت، منفي/خالي کنټرولونه او د داخلي کنټرول کنټرولونه باید د هرې ازموینې لپاره تنظیم شي ترڅو د تجربې پایلو اعتبار ارزونه وکړي.

د تجربې چمتو کول

د کارولو دمخه، وګورئ چې ایا محلول په مساوي ډول مخلوط شوی.که باران وموندل شي، دا باید د کارولو دمخه د لارښوونو سره سم منحل او مخلوط شي.د 2×PCR مکس باید د کارولو دمخه په مکرر ډول د مایکروپیپټ سره پایپټ شي او مخلوط شي ترڅو د غیر مساوي ایون توزیع مخه ونیول شي.

خبرتیا:

لارښود واخلئ او په دقت سره یې ولولئ، او د لارښود اړتیاو سره سم د تجربې دمخه چمتووالی ونیسئ.

4 ګام

د PCR عکس العمل سیسټم چمتو کړئ

د تجربوي پروتوکول له مخې، پرائمر، H2O، او 2×PCR مخلوط په مساوي ډول سره مخلوط کړئ، سینټرفیوج کړئ او په هر عکس العمل ټیوب کې یې وویشئ.

خبرتیا:

د لوی پیمانه یا اوږدمهاله ازموینې لپاره، دا سپارښتنه کیږي چې د PCR غبرګون سیسټم وکاروي چې UNG انزایم لري، کوم چې کولی شي په اغیزمنه توګه د PCR محصولاتو له امله د ایروسول ککړتیا مخه ونیسي.

5 ګام

د عکس العمل نمونه اضافه کړئ

د مستقیم PCR ټیکنالوژۍ په کارولو سره، د نیوکلیک اسید پاکولو ستړي پروسې ته اړتیا نشته، د نمونې نمونه په 10 دقیقو کې چمتو کیدی شي، او د PCR اړوند غبرګون سیسټم اضافه کیدی شي.

خبرتیا:

د پاکولو میتود د کشف کولو غوره اغیزه لري، او ترلاسه شوي محصول د ډیری کشف عکس العملونو لپاره کارول کیدی شي.

5.1: د پاڼو مستقیم پراخیدل

په لارښود کې د انځور د اندازې سره سم، د پاڼو نسج د 2-3mm قطر سره پرې کړئ او د PCR غبرګون سیسټم کې یې ځای په ځای کړئ.

یادونه: ډاډ ترلاسه کړئ چې د پاڼو ټوټې په بشپړ ډول د PCR غبرګون محلول کې ډوب شوي، او د پاڼو ډیر نسج مه اضافه کړئ.

5.2: د پاڼی د ویشلو طریقه

د پاڼی نسج د 5-7mm قطر سره پرې کړئ او په سینټرفیوج ټیوب کې یې ځای په ځای کړئ.که تاسو پاخه پاڼي غوره کړئ، مهرباني وکړئ د پاڼي د اصلي رګ د نسجونو کارولو څخه ډډه وکړئ.پایپټ 50ul Buffer P1 lysate په سینټرفیوج ټیوب کې واچوئ ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې لیسیټ کولی شي د پاڼي نسج په بشپړه توګه ډوب کړي، په تودوخې سایکلر یا فلزي حمام کې یې ځای په ځای کړي، او د 5-10 دقیقو لپاره په 95°C کې لیز کړئ.

د 50ul بفر P2 بې طرفه کولو محلول اضافه کړئ او ښه مخلوط کړئ.پایله لرونکی lysate د نمونې په توګه کارول کیدی شي او د PCR عکس العمل سیسټم کې اضافه کیدی شي.

یادونه: د نمونې اندازه د PCR سیسټم د 5-10٪ ترمنځ ده، او باید له 20٪ څخه زیاته نه وي (د مثال په توګه، د 20μl PCR سیسټم کې، د 1-2μl lysis محلول اضافه کړئ، له 4μl څخه زیات نه وي).

شپږم ګام

د PCR عکس العمل

د PCR عکس العمل ټیوب د سینټرفیوج کولو وروسته، دا په PCR وسیله کې د پراخولو لپاره کیښودل کیږي.

خبرتیا:

عکس العمل د امپلیفیکیشن لپاره غیر پاک شوي ټیمپلیټ کاروي ، نو د امپلیفیکیشن دورې شمیر د پاک شوي DNA ټیمپلیټ کارولو په پرتله 5-10 ډیر دورې دي.

7 ګام

د الکتروفورسیس کشف او د پایلو تحلیل

M: 100bp DNA زینه

1\4: د DNA د پاکولو طریقه

2\5: مستقیم PCR طریقه

3\6: خالي کنټرول

QC:

په تجربه کې ټاکل شوي د مختلف کنټرولونو ازموینې پایلې باید لاندې شرایط پوره کړي.که نه نو، د ستونزې لامل باید وڅیړل شي، او ازموینه باید د ستونزې له منځه وړلو وروسته بیا ترسره شي.

جدول 1. د کنټرول د مختلفو ګروپونو عادي ازموینې پایلې

*کله چې پلازمید د مثبت کنټرول په توګه کارول کیږي، د انډروجینس جین ازموینې پایله منفي کیدی شي

د قضاوت پایله:

A. د نمونې د endogenous جین د ازموینې پایله منفي ده، دا په ګوته کوي چې د عادي PCR کشف لپاره مناسب DNA د نمونې څخه نشي ایستل کیدی یا استخراج شوي DNA د PCR غبرګون مخنیوی کونکي لري، او DNA باید بیا استخراج شي.

B. د نمونې د endogenous جین د ازموینې پایله مثبته ده، او د exogenous جین د ازموینې پایله منفي ده، دا په ګوته کوي چې د عادي PCR کشف لپاره مناسب DNA له نمونې څخه ایستل شوی، او دا قضاوت کیدی شي چې XXX جین په نمونه کې ندی موندل شوی.

C. د نمونې د endogenous جین د ازموینې پایله مثبته ده، او د exogenous جین د ازموینې پایله مثبته ده، دا په ګوته کوي چې د عادي PCR کشف لپاره مناسب DNA له نمونې څخه ایستل شوی، او د نمونې DNA د XXX جین لري.د تایید تجربې نور هم ترسره کیدی شي.

8 ګام

ډیزاین کشف پریمر

د تجربې وروسته، د 2٪ سوډیم هایپوکلورایټ محلول او 70٪ ایتانول محلول د تجربې ساحه پاکولو لپاره وکاروئ ترڅو د چاپیریال ککړتیا مخه ونیسي.