د غبرګون سیسټم حساسیت زیات کړئ:

1. د لوړ کیفیت RNA جلا کړئ:

بریالي cDNA ترکیب د لوړ کیفیت RNA څخه راځي.د لوړ کیفیت RNA باید لږترلږه بشپړ اوږدوالی ولري او د ریورس ټرانسکریپټیس مخنیوی کونکو لکه EDTA یا SDS څخه پاک وي.د RNA کیفیت د ترتیب معلوماتو اعظمي اندازه ټاکي چې تاسو یې په cDNA کې لیږدولی شئ.د RNA د پاکولو یو عام میتود یو ګام میتود دی چې د guanidine isothiocyanate/ acid phenol په کارولو سره.د دې لپاره چې د RNase مقدار موندلو په واسطه د ککړتیا مخه ونیول شي، RNA د RNase بډایه نمونو څخه جلا شوي (لکه پانقراص) ته اړتیا لري ترڅو د لوړ کیفیت RNA ساتلو لپاره په فارملډیهایډ کې زیرمه شي، په ځانګړې توګه د اوږدې مودې ذخیره کولو لپاره.د موږک له ځیګر څخه استخراج شوی RNA په اصل کې د یوې اونۍ لپاره په اوبو کې ذخیره کولو وروسته له مینځه وړل شوی ، پداسې حال کې چې د موږک له ځیګر څخه استخراج شوی RNA د 3 کلونو لپاره په اوبو کې ذخیره کولو وروسته مستحکم پاتې کیږي.برسېره پردې، د 4 kb څخه اوږد لیږدونه د کوچنیو لیږدونو په پرتله د ټریس RNases لخوا د تخریب لپاره ډیر حساس دي.د ذخیره شوي RNA نمونو ثبات زیاتولو لپاره، RNA کیدای شي په ډیونیز شوي فارمامایډ کې منحل شي او په -70 ° C کې زیرمه شي.فارمامایډ د RNA د ساتلو لپاره کارول کیږي باید د RNA تخریب کونکي کثافاتو څخه پاک وي.د پانقراس څخه RNA لږترلږه یو کال لپاره په فارماایډ کې ساتل کیدی شي.کله چې د RNA کارولو لپاره چمتووالی ونیسئ، تاسو کولی شئ لاندې طریقه وکاروئ چې د RNA تیریږي: NaCl په 0.2M کې اضافه کړئ او د ایتانول حجم 4 ځله، د 3-5 دقیقو لپاره د خونې په حرارت درجه کې وساتئ، او د 5 دقیقو لپاره په 10,000xg کې سنټرفیوج کړئ.

2. د RNaseH-غیر فعال (RNaseH-) ریورس ټرانسکریپټیس وکاروئ:

د RNase مخنیوی کونکي ډیری وختونه د نقل نقل عکس العملونو ته اضافه کیږي ترڅو د cDNA ترکیب اوږدوالی او حاصل ډیر کړي.د RNase مخنیوی کونکي باید د لومړي سټینډ ترکیب عکس العمل په جریان کې د بفر او کمولو اجنټ (لکه DTT) په شتون کې اضافه شي ، ځکه چې د cDNA ترکیب دمخه پروسه مخنیوی کونکی ردوي ، پدې توګه پابند RNase خوشې کوي چې RNA تخریب کولی شي.د پروټین RNase مخنیوی کونکي یوازې د RNase A, B, C لخوا د RNA د تخریب مخه نیسي، او په پوستکي کې د RNase مخه نه نیسي، نو پام وکړئ چې د دې مخنیوی کونکو کارولو سره سره ستاسو د ګوتو څخه RNase معرفي نه کړئ.

ریورس ټرانسکریپټیس CDNA ته د RNA تبادله کټالیز کوي.M-MLV او AMV دواړه د خپل پولیمیریز فعالیت سربیره په پای کې د RNaseH فعالیت لري.د RNaseH فعالیت او پولیمیریز فعالیت د RNA ټیمپلیټ او DNA پریمر یا cDNA توسیع سټرینډ ترمینځ رامینځته شوي هایبرډ سټنډ لپاره یو له بل سره سیالي کوي ، او په RNA:DNA کمپلیکس کې د RNA سټینډ تخریب کوي.د RNA ټیمپلیټ د RNaseH فعالیت لخوا تخریب شوی نور نشي کولی د cDNA ترکیب لپاره د اغیزمن سبسټریټ په توګه کار وکړي ، کوم چې د cDNA ترکیب حاصل او اوږدوالی کموي.له همدې امله، دا به ګټور وي چې د ریورس ټرانسکریټیس RNaseH فعالیت له منځه یوسي یا خورا کم کړي.

SuperScript Ⅱ ریورس ټرانسکریټیس، RNaseH- MMLV ریورس ټرانسکریټیس او thermoScript ریورس ټرانسکریټیس، RNaseH- AMV، کولی شي د MMLV او AMV په پرتله ډیر مقدار او ډیر بشپړ اوږدوالی cDNA ترلاسه کړي.د RT-PCR حساسیت به د cDNA ترکیب مقدار لخوا اغیزمن شي.ThermoScript د AMV په پرتله خورا حساس دی.د RT-PCR محصولاتو اندازه د cDNA ترکیب کولو لپاره د ریورس ټرانسکریټیس وړتیا پورې محدوده ده ، په ځانګړي توګه کله چې د لوی cDNA کلون کول.د MMLV سره په پرتله، SuperScripⅡ د اوږد RT-PCR محصولاتو حاصلات د پام وړ زیات کړي.RNaseH-reverse transcriptase هم د تودوخې وړتیا لوړه کړې، نو عکس العمل د نورمال 37-42 ° C څخه لوړ تودوخې کې ترسره کیدی شي.د وړاندیز شوي ترکیب شرایطو لاندې، د oligo(dT) پریمر او 10 μCi د [α-P]dCTP څخه کار واخلئ.د لومړي ډنډ ټول حاصل د TCA د باران میتود په کارولو سره محاسبه شوی.د بشپړ اوږدوالی cDNA د اندازې ترتیب شوي بانډونو په کارولو سره تحلیل شوي او د الکلین اګاروز جیل کې شمیرل شوي.

3. د ریورس لیږد لپاره د انکیوبیشن تودوخه لوړه کړئ:

د لوړ انکیوبیشن تودوخې د RNA ثانوي جوړښت خلاصولو کې مرسته کوي ، د عکس العمل حاصلات زیاتوي.د ډیری RNA ټیمپلیټونو لپاره، د RNA او پرائمرونو په 65°C کې پرته له بفر یا مالګې څخه انقباض کول، وروسته په یخ کې چټک یخ کول به ډیری ثانوي جوړښتونه له منځه یوسي او پریمرونو ته د تړلو اجازه ورکړي.په هرصورت، ځینې ټیمپلیټونه لاهم ثانوي جوړښتونه لري، حتی د تودوخې له مینځه وړلو وروسته.د دې ستونزمن ټیمپلیټونو پراخول د ThermoScript ریورس ټرانسکریپټ په کارولو سره ترسره کیدی شي او د امپلیفیکیشن ښه کولو لپاره په لوړه تودوخه کې د ریورس لیږد عکس العمل ځای په ځای کول.د لوړ انکیوبیشن تودوخې درجه هم کولی شي ځانګړتیا زیاته کړي، په ځانګړې توګه کله چې د جین ځانګړي پریمر (GSP) د cDNA ترکیب لپاره کارول کیږي (درېیم څپرکی وګورئ).که د GSP کاروئ، ډاډ ترلاسه کړئ چې د پریمرونو Tm د متوقع انکیوبیشن تودوخې سره ورته دی.اولیګو (dT) او تصادفي پریمرونه له 60 درجو څخه پورته مه کاروئ.تصادفي پرائمرونه په 25°C کې د 10 دقیقو لپاره انکیوبیشن ته اړتیا لري مخکې لدې چې 60°C ته لوړ شي.د لوړ ریورس ټرانسکرپشن تودوخې کارولو سربیره، ځانګړتیا هم د RNA/primer مکس په مستقیم ډول د 65 ° C denaturation تودوخې څخه د ریورس ټرانسکرپشن انکیوبیشن تودوخې ته لیږدولو او د مخکې ګرم شوي 2× عکس العمل مخلوط (cDNA هوټ سټارټ ترکیب) اضافه کولو سره هم ښه کیدی شي.دا طریقه مرسته کوي چې د انټرمالیکولر بیس جوړه مخه ونیسي چې په ټیټ حرارت کې واقع کیږي.د RT-PCR لپاره د څو تودوخې بدلول اړین دي د تودوخې سایکلر په کارولو سره ساده کیدی شي.

Tth ترموسټبل پولیمیریز د Mg2+ په شتون کې د DNA پولیمریز په توګه او د Mn2+ په شتون کې د RNA پولیمیریز په توګه کار کوي.دا د 65 درجې سانتي ګراد په اعظمي تودوخه کې ګرم ساتل کیدی شي.په هرصورت، د PCR په جریان کې د Mn2+ شتون وفاداري کموي، کوم چې Tth پولیمیریز د لوړ دقیقیت امپلیفیکیشن لپاره لږ مناسب کوي، لکه د cDNA کلونینګ.برسېره پردې، Tth د ریورس ټرانسکرپشن موثریت لري، کوم چې حساسیت کموي، او له دې امله چې ریورس لیږد او PCR د یو واحد انزایم سره ترسره کیدی شي، د کنټرول تعاملات د ریورس لیږد پرته د cDNA امپلیفیکیشن محصولات د جینومیک DNA ککړونکي سره پرتله کولو لپاره نشي کارول کیدی.د امپریشن محصولات جلا شوي.

4. اضافه کونکي چې د برعکس لیږد ته وده ورکوي:

د ګلیسرول او DMSO په شمول اضافه کونکي د لومړي سټنډ ترکیب عکس العمل کې اضافه کیږي ، کوم چې کولی شي د نیوکلیک اسید ډبل سټنډ ثبات کم کړي او د RNA ثانوي جوړښت خلاص کړي.تر 20٪ ګلیسیرول یا 10٪ DMSO اضافه کیدی شي پرته لدې چې د SuperScript II یا MMLV فعالیت اغیزه وکړي.AMV کولی شي د فعالیت له لاسه ورکولو پرته تر 20٪ ګیلیسرول برداشت کړي.د دې لپاره چې په SuperScriptⅡ کې د RT-PCR حساسیت لوړ شي، د 10٪ ګلیسرول اضافه کیدی شي او په 45 درجې سانتي ګراد کې کیښودل شي.که چیرې د ریورس لیږد عکس العمل محصول 1/10 په PCR کې اضافه شي، نو د امپلیفیکیشن غبرګون کې د ګلیسرول غلظت 0.4٪ دی، کوم چې د PCR مخنیوی لپاره کافي ندي.

5. د RNaseH درملنه:

د PCR څخه دمخه د RNaseH سره د cDNA ترکیب عکس العمل درملنه کولی شي حساسیت زیات کړي.د ځینو نمونو لپاره، داسې انګیرل کیږي چې د CDNA ترکیب غبرګون کې RNA د امپلیفیکیشن محصولاتو د پابندۍ مخه نیسي، په دې حالت کې د RNaseH درملنه کولی شي حساسیت زیات کړي.عموما، د RNaseH درملنه اړینه ده کله چې د اوږد بشپړ اوږدوالی cDNA هدف ټیمپلیټونه پراخ شي، لکه د ټیټ کاپي تیوبروس سکیروسیس II.د دې ستونزمن ټیمپلیټ لپاره، د RNaseH درملنې د SuperScript II یا AMV-synthesized cDNA لخوا تولید شوي سیګنال ته وده ورکړه.د ډیری RT-PCR عکس العملونو لپاره، د RNaseH درملنه اختیاري ده، ځکه چې د PCR د ډینیټوریشن مرحله په 95 ° C کې عموما په RNA:DNA کمپلیکس کې RNA هایډرولیز کوي.

6. د کوچني RNA د کشف میتود ښه کول:

RT-PCR په ځانګړې توګه ننګونه کوي کله چې یوازې لږ مقدار RNA شتون ولري.ګلایکوجن د RNA د جلا کولو پرمهال د کیریر په توګه اضافه شوي د وړو نمونو حاصلاتو زیاتولو کې مرسته کوي.RNase-free glycogen په ورته وخت کې د Trizol اضافه کولو سره اضافه کیدی شي.ګلایکوجن په اوبو کې محلول کېدونکی دی او د RNA سره په اوبو کې ساتل کیدی شي ترڅو د ورښت سره مرسته وکړي.د نمونو لپاره چې د 50 ملی ګرامه نسج یا 106 کلتور شوي حجرو څخه کم وي، د RNase-free glycogen وړاندیز شوی غلظت 250 μg/ml دی.

د SuperScript II په کارولو سره د ریورس ټرانسکرپشن عکس العمل ته د acetylated BSA اضافه کول کولی شي حساسیت زیات کړي، او د RNA لږ مقدار لپاره، د SuperScript II اندازه کموي او د RNaseOut نیوکلیز انابیټر 40 واحدونه اضافه کولی شي د کشف کچه لوړه کړي.که چیرې ګلایکوجن د RNA جلا کولو پروسې کې کارول کیږي، بیا هم سپارښتنه کیږي چې BSA یا RNase inhibitor اضافه کړي کله چې د سپر سکریپټ II د ریورس لیږد عکس العمل لپاره کاروي.

二、د RT-PCR ځانګړتیا زیاته کړئ

1. د CND ترکیب:

د لومړي سټنډ cDNA ترکیب د دریو مختلف میتودونو په کارولو سره پیل کیدی شي ، د کوم نسبي ځانګړتیا د ترکیب شوي cDNA مقدار او ډول اغیزه کوي.

د تصادفي پریمر طریقه د دریو میتودونو څخه لږ تر لږه مشخصه وه.پرائمر د لیږد په اوږدو کې په ډیری سایټونو کې انیل کوي، لنډ، جزوی اوږدوالی cDNAs تولیدوي.دا طریقه په مکرر ډول د 5′ پای ترتیبونو ترلاسه کولو لپاره کارول کیږي او د RNA ټیمپلیټونو څخه د ثانوي جوړښت ساحې یا د پای ته رسیدو سایټونو سره cDNA ترلاسه کولو لپاره کارول کیږي چې نشي کولی د ریورس ټرانسکریپټیس لخوا نقل شي.تر ټولو اوږده cDNA ترلاسه کولو لپاره، د RNA سره د پرائمر تناسب په هر RNA نمونه کې باید په تجربه سره وټاکل شي.د تصادفي پریمرونو پیل غلظت په هر 20 μl عکس العمل کې له 50 څخه تر 250 ng پورې و.څرنګه چې cDNA د تصادفي پرائمرونو په کارولو سره له ټول RNA څخه ترکیب شوی په اصل کې ریبوسومال RNA دی، پولی(A)+RNA عموما د نمونې په توګه غوره کیږي.

اولیګو (dT) پریمر د تصادفي پریمرونو په پرتله خورا مشخص دي.دا د پولی (A) لکۍ ته هایبرډیز کوي چې د ډیری یوکریوټیک mRNAs په 3′ پای کې موندل کیږي.ځکه چې پولی (A)+ RNA د ټول RNA نږدې 1٪ څخه تر 2٪ پورې دی، د cDNA اندازه او پیچلتیا د تصادفي پریمرونو په پرتله خورا کمه ده.د دې د لوړ ځانګړتیا له امله، oligo(dT) عموما د RNA تناسب ته د پرائمر او پولی (A)+ انتخاب ته اړتیا نلري.دا سپارښتنه کیږي چې د 0.5μg oligo(dT) په هر 20μl غبرګون سیسټم کې وکاروئ.oligo(dT)12-18 د ډیری RT-PCR لپاره مناسب دی.د ThermoScript RT-PCR سیسټم د لوړ انکیوبیشن تودوخې لپاره د غوره حرارتي ثبات له امله oligo(dT)20 وړاندیز کوي.

د جین ځانګړي پرائمرونه (GSP) د ریورس لیږد مرحلې لپاره خورا ځانګړي پریمرونه دي.GSP یو انټي سینس اولیګونیوکلیوټایډ دی چې کولی شي په ځانګړي ډول د RNA هدف ترتیب ته هایبرډیز کړي ، د تصادفي پریمرونو یا اولیګو (dT) برعکس ، کوم چې ټولو RNAs ته انیل کوي.ورته مقررات چې د PCR پرائمر ډیزاین کولو لپاره کارول کیږي د GSP ډیزاین کې د ریورس لیږد عکس العملونو کې پلي کیږي.GSP کیدای شي د امپلیفیکیشن پریمر په څیر ورته ترتیب وي چې د mRNA 3′-ډیری پای ته نښلوي، یا GSP کیدای شي د ریورس امپلیفیکیشن پریمر د ښکته جریان انیل کولو لپاره ډیزاین شي.د ځینو پراخو مضامینو لپاره، د بریالي RT-PCR لپاره له یو څخه ډیر انټي سینس پریمر ډیزاین کولو ته اړتیا لري ځکه چې د هدف RNA ثانوي جوړښت ممکن د پریمر پابندۍ مخه ونیسي.دا سپارښتنه کیږي چې د 1 pmol antisense GSP د 20 μl د لومړي سټینډ ترکیب عکس العمل کې وکاروئ.

2. د ریورس لیږد لپاره د انکیوبیشن تودوخې لوړ کړئ:

د دې لپاره چې د GSP ځانګړتیا څخه د بشپړې ګټې اخیستنې لپاره، یو ریورس ټرانسکریټیس باید د لوړې تودوخې وړتیا سره وکارول شي.د تودوخې وړ ریورس ټرانسکریټسونه په لوړه تودوخه کې د عکس العمل سختۍ زیاتولو لپاره انکیوبیټ کیدی شي.د مثال په توګه، که چیرې یو GSP په 55 ° C کې سره وصل شي، د GSP ځانګړتیا به په بشپړه توګه ونه کارول شي که چیرې AMV یا M-MLV د 37 درجې C ټیټ شدت کې د ریورس لیږد لپاره کارول کیږي.په هرصورت، SuperScript II او ThermoScript په 50 ° C یا لوړ کې غبرګون کیدی شي، کوم چې په ټیټ حرارت کې تولید شوي غیر مشخص محصولات له منځه یوسي.د اعظمي مشخصاتو لپاره، RNA/primer مخلوط په مستقیم ډول د 65 ° C د تودوخې له تودوخې څخه د ریورس ټرانسکرپشن انکیوبیشن تودوخې ته لیږدول کیدی شي او د مخکې ګرم شوي 2× عکس العمل مخلوط (cDNA ترکیب ګرم پیل) کې اضافه کیدی شي.دا مرسته کوي چې په ټیټه تودوخه کې د انټرمالکولر اساس جوړیدو مخه ونیسي.د RT-PCR لپاره د تودوخې ډیری لیږدونه د تودوخې سایکلر په کارولو سره ساده کیدی شي.

3. د جینومیک DNA ککړتیا کموي:

یو احتمالي مشکل چې د RT-PCR سره مخ کیږي په RNA کې د جینومیک DNA ککړتیا ده.د ښه RNA د جلا کولو میتود کارول، لکه Trizol Reagent، به د جینومیک DNA اندازه کم کړي چې د RNA تیاری ککړوي.د جینومیک DNA څخه اخیستل شوي محصولاتو څخه د مخنیوي لپاره، RNA د امپلیفیکیشن درجې DNase I سره درملنه کیدی شي ترڅو د برعکس لیږد دمخه د ککړ شوي DNA لیرې کړي.د DNase I هضم په 2.0 mM EDTA کې د 10 دقیقو لپاره په 65 ° C کې د نمونو په مینځلو سره پای ته ورسید.EDTA کولی شي د مګنیزیم آئنونه چیلایټ کړي، په لوړه تودوخه کې د مګنیزیم ایون پورې تړلي RNA هایدرولیسس مخه ونیسي.

د دې لپاره چې پراخه شوي cDNA د جینومیک DNA امپلیفیکیشن محصولاتو ککړولو څخه جلا کړي ، پریمر ډیزاین کیدی شي چې هر اینیل د جلا جلا جلا کولو لپاره وي.د PCR محصولات چې له cDNA څخه اخیستل شوي د هغو په پرتله لنډ وي چې د ککړ شوي جینومیک DNA څخه اخیستل شوي.برسېره پردې، د کنټرول تجربه پرته له دې چې په هر RNA ټیمپلیټ کې د برعکس لیږد څخه ترسره شي ترڅو معلومه کړي چې ایا ورکړل شوې ټوټه د جینومیک DNA یا cDNA څخه اخیستل شوې وه.د PCR محصول چې د ریورس لیږد پرته ترلاسه شوی د جینوم څخه اخیستل شوی.