Ⅰ. د غبرګون سیسټم حساسیت زیات کړئ:
1. د لوړ کیفیت RNA جلا کړئ:
بریالي cDNA ترکیب د لوړ کیفیت RNA څخه راځي.د لوړ کیفیت RNA باید لږ تر لږه ټول اوږد یقیني کړي او مخنیوی کونکي نلري چې د ثبت کولو انزایمونه نلري، لکه EDTA یا SDS.د RNA کیفیت د ترتیب معلوماتو اعظمي ارزښت ټاکي چې تاسو یې cDNA ته لیږدولی شئ.د RNA د پاکولو عمومي میتود د isoocyanate/acidophenol کارولو یو ګام میتود دی.د RNase د ککړتیا د مخنیوي لپاره، RNA د RNase بډایه نمونې څخه جلا شوي (لکه پانقراص) د لوړ کیفیت RNA د خوندي کولو لپاره د فارملډایډ ذخیره کولو ته اړتیا لري، کوم چې حتی د اوږدې مودې ذخیره کولو لپاره خورا ډیر دی.د موږک له ځیګر څخه استخراج شوی RNA اساسا په اوبو کې د یوې اونۍ ذخیره کولو وروسته تخریب شوی و ، پداسې حال کې چې د موږک له سپلین څخه استخراج شوی RNA په اوبو کې د دریو کلونو ذخیره کولو وروسته مستحکم پاتې شو.برسېره پردې، د 4kb څخه لوی لیږدونه د کوچنیو لیږدونو په پرتله د RNase تخریب موندلو لپاره ډیر حساس دي.د ذخیره کولو RNA نمونې د ثبات د زیاتوالي لپاره، RNA کیدای شي د آیون په میتالمامین کې منحل شي، او په -70 °C کې زیرمه کیږي.تایلایډ د RNA د خوندي کولو لپاره کارول کیږي باید متفرقه توکي ولري چې RNA تخریب کړي.RNA، چې د پانقراص څخه اخیستل کیږي، لږترلږه یو کال لپاره په میتالامین کې خوندي کیدی شي.کله چې تاسو د RNA کارولو ته چمتو یاست، تاسو کولی شئ د RNA د تیرولو لپاره لاندې طریقې وکاروئ: NaCl په 0.2m کې اضافه کړئ او د ایتانول حجم 4 ځله، د خونې د حرارت درجه د 3-5 دقیقو لپاره، او د 5 دقیقو لپاره 10,000 × ګرام سینټرفیوګل.
2. د RNaseH فعالیت (RNaseH-) پرته د ریورس ټرانسکریټیس څخه کار واخلئ:
د RNase مخنیوی کونکي ډیری وختونه د نقل نقل عکس العملونو ته اضافه کیږي ترڅو د cDNA ترکیب اوږدوالی او حاصل ډیر کړي.RNase inhibitor په لومړي زنځیر ترکیب عکس العمل کې د بفرونو او کمولو اجنټانو لکه DTT په شتون کې اضافه کیږي ځکه چې د CDNA دمخه ترکیب پروسه مخنیوی کونکي ردوي ، پدې توګه پابند RNases خوشې کوي چې RNA تخریب کوي.د پروټین RNase مخنیوی کونکي یوازې د RNase A, B, C لخوا د RNA د تخریب مخه نیسي او په پوټکي کې د RNases مخه نه نیسي نو باید پاملرنه وشي چې د دې مخنیوی کونکو کارولو سره سره د ګوتو څخه RNases معرفي نشي.
ریورس ټرانسکریپټیس په cDNA کې د RNA تبادله کټالیز کوي.M-MLV او AMV دواړه د خپل پولیمیریز فعالیت سربیره په پای کې د RNaseH فعالیت لري.د RNaseH فعالیت د پولیمیریز فعالیت سره سیالي کوي د هیټروزایګوس سټنډونو لپاره چې د RNA ټیمپلیټونو او DNA پریمرونو یا cDNA توسیع سټنډونو ترمینځ رامینځته شوي ، او RNA تخریب کوي: RNA په DNA کمپلیکسونو کې.د RNA ټیمپلیټونه چې د RNaseH فعالیت لخوا تخریب شوي نور نشي کولی د cDNA ترکیب لپاره د اغیزمن سبسټریټ په توګه وکارول شي ، د cDNA ترکیب حاصل او اوږدوالی کموي.په دې توګه د ریورس ټرانسکریټیس RNaseH فعالیت له مینځه وړل یا خورا کمول به خورا ګټور وي.
SuperScriptⅡ ریورس ټرانسکریټیس، د RNaseH MMLV ریورس ټرانسکریټیس- او د thermoScript ریورس ټرانسکریټیس، د RNaseH AMV- د MMLV او AMV په پرتله ډیر بشپړ اوږدوالی cDNA ترلاسه کړ.د RT-PCR حساسیت د cDNA ترکیب شوي مقدار لخوا اغیزمن کیږي.ThermoScript د AMV په پرتله خورا حساس دی.د RT-PCR محصولاتو اندازه د CDNA ترکیب کولو لپاره د ریورس ټرانسکریپټیس وړتیا پورې محدوده ده ، په ځانګړي توګه کله چې لوی Cdnas کلون کول.د MMLV سره په پرتله، SuperScripⅡ د اوږد RT-PCR محصولاتو حاصلات د پام وړ زیات کړي.د RNaseH- ریورس ټرانسکریپټیس هم حرارتي ثبات زیاتوي، نو عکس العمل د 37-42 ℃ له نورمال څخه لوړ تودوخې کې ترسره کیدی شي.د وړاندیز شوي ترکیب شرایطو لاندې، oligo(dT) پریمر او 10μCi [alpha-p]dCTP کارول شوي.د لومړي زنځیر ټول تولید د TCA د باران میتود په کارولو سره محاسبه شوی.د بشپړ اوږدوالی cDNA د اندازې ترتیب شوي پټې لرې کولو او د الکلین اګاروز جیل کې شمیرلو په کارولو سره تحلیل شوي.
3. د ریورس لیږد د تودوخې د ساتنې تودوخې لوړ کړئ:
د تودوخې لوړه ساتل د RNA ثانوي جوړښت خلاصولو کې مرسته کوي او د عکس العمل حاصلات زیاتوي.د ډیری RNA ټیمپلیټونو لپاره، RNA او پریمر په 65 ° C کې پرته له بفر یا مالګې ساتل او بیا یې په یخ کې په چټکۍ سره یخ کول ډیری ثانوي جوړښتونه له مینځه وړي او پریمرونو ته د تړلو اجازه ورکوي.په هرصورت، ځینې ټیمپلیټونه لاهم ثانوي جوړښت لري، حتی د حرارتي تخریب وروسته.د دې ستونزمن ټیمپلیټونو پراخول د ThermoScript ریورس ټرانسکریپټ په کارولو سره ترسره کیدی شي او د امپلیفیکیشن ښه کولو لپاره په لوړه تودوخې کې د ریورس ټرانسکریټیس عکس العمل په ځای کولو سره ترسره کیدی شي.د تودوخې لوړه ساتل هم کولی شي ځانګړتیا زیاته کړي، په ځانګړې توګه کله چې د cDNA ترکیب د جین ځانګړي پریمر (GSPS) په کارولو سره ترسره کیږي (درېیم څپرکی وګورئ).که د GSP کاروئ، ډاډ ترلاسه کړئ چې د پریمر د Tm ارزښت د اټکل شوي تودوخې درجه سره ورته ده.اولیګو (dT) او تصادفي پریمرونه له 60 ℃ څخه پورته مه کاروئ.تصادفي پرائمر باید د 10 دقیقو لپاره په 25 ℃ کې وساتل شي مخکې لدې چې 60 ℃ ته لوړ شي.د لوړ ریورس ټرانسکرپشن تودوخې کارولو سربیره ، ځانګړتیا د RNA/ پریمر مخلوط په مستقیم ډول د 65 ℃ څخه د ریورس ټرانسکریپشن تودوخې تودوخې ته د تودوخې تودوخې ته لیږدولو او د دمخه تودوخې 2× عکس العمل مخلوط (cDNA حرارتي پیل ترکیب) اضافه کولو سره ښه کیدی شي.دا طریقه مرسته کوي چې د انټرمالیکولر بیس جوړه مخه ونیسي چې په ټیټ حرارت کې واقع کیږي.د PCR وسیلې کارول د RT-PCR لپاره اړین د تودوخې ډیری سویچونه ساده کوي.
د Tth تودوخې ثبات لرونکي پولیمیریز د Mg2+ په شتون کې د DNA پولیمریز او د Mn2+ په شتون کې د RNA پولیمیریز په توګه کار کوي.دا کولی شي تر 65 ℃ پورې تودوخه وساتي.په هرصورت، د PCR په جریان کې د Mn2+ شتون وفاداري کموي، کوم چې Tth پولیمیریز د لوړ دقیقیت لوړولو لپاره لږ مناسب کوي، لکه د cDNA کلونینګ.برسېره پردې، Tth په ریورس لیږد کې لږ اغیزمن دی، کوم چې حساسیت کموي، او ځکه چې یو واحد انزایم کولی شي ریورس لیږد او PCR ترسره کړي، د کنټرول تعاملات د ریورس لیږد پرته نشي کارول کیدی ترڅو د ککړ شوي جینومیک DNA څخه د cDNA پراخ شوي محصولاتو توپیر وکړي.
4. اضافې چې د برعکس لیږد ته وده ورکوي:
د لومړي زنځیر ترکیب عکس العمل کې د ګلیسرین او DMSO په شمول د اضافه کولو اضافه کول کولی شي د نیوکلیک اسید ډبل سټنډ ثبات کم کړي او د RNA ثانوي جوړښت خلاص کړي.تر 20٪ ګیلیسرین یا 10٪ DMSO اضافه کیدی شي پرته لدې چې د SuperScriptⅡ یا MMLV فعالیت اغیزه وکړي.AMV کولی شي د فعالیت کمولو پرته تر 20٪ ګیلیسرول برداشت کړي.په SuperScriptⅡ کې د RT-PCR حساسیت اعظمي کولو لپاره، 10٪ ګلیسرول اضافه کیدی شي او په 45℃ کې موصل شي.که د Retrotransscription-reaction محصول 1/10 په PCR کې اضافه شي، د امپلیفیکیشن غبرګون کې د ګلیسرول غلظت 0.4٪ دی، کوم چې د PCR مخنیوی لپاره کافي ندي.
5. د RNaseH پروسس کول:
حساسیت د PCR څخه دمخه د RNaseH سره د cDNA ترکیب عکس العملونو درملنې سره ښه کیدی شي.د ځینو نمونو لپاره، داسې انګیرل کیږي چې د CDNA ترکیب غبرګون کې RNA د پراخ شوي محصولاتو د پابندۍ مخه نیسي، په دې حالت کې د RNaseH درملنه کولی شي حساسیت زیات کړي.عموما، د RNaseH درملنه د نسبتا اوږد بشپړ اوږدوالي cDNA هدف ټیمپلیټ پراخولو لپاره اړینه ده، لکه د ټیټ کاپي سره د تیوبروس سکیروسیس Ⅱ.د دې ستونزمن ټیمپلیټ لپاره، RNaseH د CDNA لخوا رامینځته شوي سیګنال ته وده ورکړه چې د SuperScriptⅡ یا AMV لخوا ترکیب شوي.د ډیرو RT-PCR تعاملاتو لپاره، د RNaseH درملنه اختیاري ده ځکه چې د 95℃ موصل شوي PCR ډینیټوریشن مرحله په عموم ډول د RNA څخه RNA هایدروولیز کوي: DNA کمپلیکس.
6. د RNA د لږ مقدار موندلو لپاره غوره میتودونه:
RT-PCR په ځانګړي ډول ننګونه کوي کله چې یوازې لږ مقدار RNA شتون ولري.د RNA جلا کولو په جریان کې د کیریر په توګه د ګلایکوجن اضافه کول د وړو نمونو حاصلاتو زیاتوالي کې مرسته کوي.د RNase څخه پاک ګلایکوجن په ورته وخت کې د Trizol په څیر اضافه کیدی شي.ګلایکوجن په اوبو کې محلول کېدونکی دی او کولی شي د RNA سره د اوبو په مرحله کې پاتې شي ترڅو په ورښت کې مرسته وکړي.د RNase-free glycogen وړاندیز شوی غلظت د 50mg نسج یا 106 کلتور شوي حجرو څخه کم نمونو لپاره 250μg/ml دی.
د SuperScriptⅡ په کارولو سره د ټرانسکریپشن عکس العملونو د بیرته راګرځولو لپاره د acetylated BSA اضافه کولی شي حساسیت زیات کړي، او د RNA لږ مقدار لپاره، د SuperScriptⅡ اندازه کموي او د RnaseOut نیوکلیز انابیټر 40 واحدونه اضافه کولی شي د کشف کچه ښه کړي.که چیرې ګلایکوجن د RNA په جلا کولو کې کارول کیږي، د SuperScriptⅡ په کارولو سره د لیږد عکس العملونو بیرته راګرځولو لپاره د BSA یا RNase مخنیوی کونکو اضافه کول لاهم سپارښتنه کیږي.
Ⅱ. د RT-PCR ځانګړتیا زیاته کړئ
1. د cNDA ترکیب:
درې مختلف میتودونه کارول کیدی شي د لومړي سټینډ cDNA ترکیب پیل کړي ، او د هرې میتود نسبي ځانګړتیا د ترکیب شوي cDNA مقدار او ډول اغیزه کوي.
تصادفي پریمر میتود د دریو میتودونو څخه لږ تر لږه مشخص دی.پرائمرونه د لیږد په اوږدو کې په ډیری سایټونو کې تړل شوي ترڅو لنډ، جزوی اوږدوالی cDNA تولید کړي.دا طریقه اکثرا د RNA ټیمپلیټونو څخه د ثانوي ساختماني ساحو سره یا د پای ته رسیدو سایټونو سره د 5′ ترمینل ترتیبونو او cDNA ترلاسه کولو لپاره کارول کیږي چې د ټرانسکریپټ ریورس نقل نشي کولی.تر ټولو اوږده cDNA ترلاسه کولو لپاره، د RNA سره د پرائمر تناسب په هر RNA نمونه کې باید په تجربه سره وټاکل شي.د تصادفي پریمرونو لومړنی غلظت د 50 څخه تر 250ng پورې په هر 20μl غبرګون سیسټم کې دی.ځکه چې cDNA د تصادفي پرائمرونو په کارولو سره د ټول RNA څخه ترکیب شوی په عمده توګه ریبوسومال RNA دی، پولی (A) + RNA عموما د نمونې په توګه غوره کیږي.
د اولیګو (dT) پیل د تصادفي پریمرونو په پرتله خورا مشخص دی.دا د پولی (A) لکۍ سره هایبرډیز کوي چې په ډیری یوکریوټیک حجرو کې د mRNA په 3′ پای کې موندل کیږي.ځکه چې پولی (A)+RNA د ټول RNA شاوخوا 1٪ څخه تر 2٪ پورې دی، د cDNA اندازه او پیچلتیا د هغه په پرتله خورا کمه ده که چیرې تصادفي پریمرونه کارول شوي وي.د دې د لوړ ځانګړتیا له امله، oligo(dT) عموما د RNA لپاره د پریمر تناسب او پولی (A)+ انتخاب ته اړتیا نلري.دا سپارښتنه کیږي چې د 0.5μg oligo(dT) په هر 20μl غبرګون سیسټم کې وکاروئ.oligo(dT)12-18 د ډیری RT-PCR لپاره مناسب دی.ThermoScript RT-PCR سیسټم د ښه حرارتي ثبات له امله اولیګو (dT) 20 چمتو کوي او د لوړې تودوخې ساتلو لپاره مناسب دی.
د جین ځانګړي پرائمرونه (GSP) د ریورس لیږد مرحلې لپاره غوره ځانګړي پریمرونه دي.GSP یو انټي سینس oligonucleoside دی چې کولی شي په ځانګړي ډول د RNA د منزل ترتیبونو سره هایبرډیز کړي ، د دې پرځای چې ټول Rnas لکه تصادفي پریمر یا اولیګو (dT) انیل کړي.هغه مقررات چې د PCR پرائمر ډیزاین کولو لپاره کارول کیږي د ریورس لیږد عکس العمل GSP ډیزاین باندې هم پلي کیږي.GSP کیدای شي د امپلیفیکیشن پریمر په څیر ترتیب وي لکه څنګه چې د mRNA3 په پای کې annealed شوی وي، یا GSP کیدای شي ډیزاین شي چې د ریورس امپلیفیکیشن پریمر سره د لاندې جریان سره انیل شي.د ځینو پراخو شیانو لپاره، دا اړینه ده چې د بریالي RT-PCR لپاره له یو څخه ډیر انټي سینس پریمر ډیزاین کړئ ځکه چې د هدف RNA ثانوي جوړښت ممکن د پریمر د تړل کیدو مخه ونیسي.دا وړاندیز کیږي چې د 1pmol antisense GSP د 20μl په لومړي زنځیر ترکیب عکس العمل سیسټم کې وکاروئ.
2. د ریورس لیږد د تودوخې د ساتنې تودوخې لوړ کړئ:
د GSP ځانګړتیا څخه د بشپړې ګټې اخیستنې لپاره، د لوړ حرارتي ثبات سره ریورس ټرانسکریټیس باید وکارول شي.د تودوخې مستحکم ریورس ټرانسکریټیس په لوړه تودوخه کې موصل کیدی شي ترڅو د عکس العمل شدت زیات کړي.د مثال په توګه، که چیرې یو GSP په 55 درجې سانتي ګراد کې انیل شي، نو د GSP ځانګړتیا په بشپړه توګه نه کارول کیږي که چیرې د AMV یا M-MLV په کارولو سره په 37 ° C کې د ټيټ سختۍ سره د ریورس لیږد ترسره شي.په هرصورت، SuperScripⅡ او ThermoScript کولی شي په 50℃ یا لوړ کې غبرګون وکړي، کوم چې په ټیټ حرارت کې تولید شوي غیر مشخص محصولات له مینځه وړي.د اعظمي مشخصاتو لپاره ، د RNA / پریمر مخلوط د 65 ° C ډینیچریشن تودوخې څخه مستقیم د مخکینۍ تودوخې 2 x عکس العمل مخلوط (د cDNA ترکیب حرارتي پیل) اضافه کولو سره د برعکس ټرانسکرپشن هولډ تودوخې ته لیږدول کیدی شي.دا مرسته کوي چې په ټیټه تودوخه کې د مالیکولونو تر مینځ د اساس جوړیدو مخه ونیسي.د PCR وسیلې کارول د RT-PCR لپاره اړین د تودوخې ډیری لیږدونه ساده کوي.
3. د جینومیک DNA ککړتیا کم کړئ:
د RT-PCR سره یو احتمالي مشکل دا دی چې RNA د جینومیک DNA ککړوي.د RNA د جلا کولو غوره میتودونو کارول، لکه Trizol Reagent، د RNA په تیاریو کې د جینومیک DNA ککړتیا کموي.د جینومیک DNA څخه تولید شوي محصولاتو څخه مخنیوي لپاره، RNA د امپلیفیکیشن درجې DnasⅠ سره درملنه کیدی شي ترڅو د نقل شوي نقل څخه مخکې ککړ شوي DNA لرې کړي.نمونې د DNaseⅠ هضم ختمولو لپاره د 10 دقیقو لپاره په 2.0mM EDTA کې په 65℃ کې ساتل شوي.EDTA د مګنیزیم آئنونو چیلیټ کوي ترڅو د مګنیزیم آئن انحصار RNA هایدرولیسس مخه ونیسي چې په لوړه تودوخه کې پیښیږي.
د دې لپاره چې پراخه شوي cDNA د جینوم DNA امپلیفیکیشن محصول څخه جلا کړي ، پریمرونه چې د جلا شوي ایکسون سره په جلا توګه انیل کوي ډیزاین کیدی شي.د PCR محصولات چې له cDNA څخه اخیستل شوي د هغو په پرتله لنډ وي چې د ککړ شوي جینومیک DNA څخه اخیستل شوي.یو کنټرول شوی تجربه پرته له ریورس لیږدونې پرته په هر RNA ټیمپلیټ کې ترسره کیږي ترڅو معلومه کړي چې ایا ورکړل شوې ټوټه د جینومیک DNA یا cDNA څخه ده.د PCR محصولات چې د ریورس لیږد په نشتوالي کې ترلاسه شوي د جینوم څخه اخیستل شوي.
اړوند محصول
- یو ګام کټ د دې وړتیا ورکوي چې ریورس لیږد او PCR په ورته ټیوب کې ترسره شي.دا یوازې د ټیمپلیټ RNA، ځانګړي PCR پریمرونو او RNase-Free ddH اضافه کولو ته اړتیا لري2O.
- د RNA ریښتیني وخت کمیتي تحلیل په ګړندي او دقیق ډول ترسره کیدی شي.
- دا کټ یو ځانګړی فورجین ریورس ټرانسکرپشن ریجنټ کاروي او د فورجین هوټ سټار ټیک DNA پولیمیریز د ځانګړي عکس العمل سیسټم سره یوځای د عکس العمل د لوړولو موثریت او ځانګړتیا ته په مؤثره توګه وده ورکوي.
- د عکس العمل مطلوب سیسټم د عکس العمل لوړ کشف حساسیت ، قوي حرارتي ثبات او غوره زغم لري.
- د gDNA لرې کولو وړ وړتیا ، کوم چې کولی شي په 2 دقیقو کې په ټیمپلیټ کې gDNA لرې کړي.
- اغیزمن ریورس لیږد سیسټم، دا یوازې 15 دقیقې وخت نیسي ترڅو د لومړي سټینډ cDNA ترکیب بشپړ کړي.
- پیچلي ټیمپلیټونه: د لوړ GC مینځپانګې او پیچلي ثانوي جوړښت سره ټیمپلیټونه هم د لوړ موثریت سره بدلیدلی شي.
- د لوړ حساسیت ریورس ټرانسکرپشن سیسټم ، د pg کچې ټیمپلیټونه هم د لوړ کیفیت cDNA ترلاسه کولی شي.
- د ریورس لیږد سیسټم لوړ حرارتي ثبات لري، د غوره غبرګون تودوخه 42 ℃ ده، او دا لاهم په 50 ℃ کې د ریورس لیږد ښه فعالیت لري.
د پوسټ وخت: مارچ-07-2023
