1. اساسي پوهه (که تاسو غواړئ تجربه برخه وګورئ، مهرباني وکړئ مستقیم دویمې برخې ته انتقال کړئ)
د دودیز PCR د مشتق عکس العمل په توګه ، د ریښتیني وخت PCR په عمده توګه د PCR امپلیفیکیشن عکس العمل په هر دور کې د فلوروسینس سیګنال بدلون له لارې په ریښتیني وخت کې د امپلیفیکیشن محصول مقدار بدلوي ، او د ct ارزښت او معیاري وکر ترمینځ اړیکې له لارې د پیل شوي ټیمپلیټ مقدار تحلیل کوي.
د RT-PCR مشخص معلومات دياساسی کرښه, د فلوروسینس حداود Ct ارزښت.
اساسی کرښه | د 3rd-15th دورې د فلوروسینس ارزښت بیس لاین (بیس لاین) دی ، کوم چې د اندازه کولو ځینې وختونه د غلطۍ له امله رامینځته کیږي. |
حد ( حد): | د فلوروسینس کشف حد ته اشاره کوي چې د امپلیفیکیشن وکر د اضطراري ودې په سیمه کې په مناسب موقعیت کې ټاکل شوي ، په عمومي ډول د بیس لاین معیاري انحراف 10 ځله. |
د CT ارزښت: | دا د PCR دورې شمیره ده کله چې په هر عکس العمل ټیوب کې د فلوروسینس ارزښت حد ته ورسیږي. د Ct ارزښت د ابتدايي ټیمپلیټ مقدار سره متناسب دی. |
د RT-PCR لپاره د لیبل کولو عام میتودونه:
طریقه | ګټه | نیمګړتیا | د غوښتنلیک ساحه |
SYBR شنهⅠ | پراخه تطبیق، حساس، ارزانه او اسانه | د پریمر اړتیاوې لوړې دي، د غیر مشخص بانډونو سره مخ دي | دا د مختلفو هدفونو جینونو کمیتي تحلیل، د جین بیان په اړه څیړنې، او د ټرانسجنیک بیا جوړونکي څارویو او نباتاتو څیړنې لپاره مناسب دی. |
تقمان | ښه ځانګړتیا او لوړ تکرار وړتیا | نرخ لوړ دی او یوازې د ځانګړو اهدافو لپاره مناسب دی. | د رنځجن کشف، د مخدره توکو د مقاومت جین څیړنه، د مخدره توکو د اغیزمنتیا ارزونه، د جینیاتي ناروغیو تشخیص. |
مالیکولر بیکون | لوړ ځانګړتیا، فلوروسینس، ټیټ پس منظر | بیه لوړه ده، دا یوازې د یو ځانګړي هدف لپاره مناسبه ده، ډیزاین ستونزمن دی، او بیه لوړه ده. | د ځانګړي جین تحلیل، د SNP تحلیل |
2. تجربوي ګامونه
2.1 د تجربې ګروپ کولو په اړه- په ګروپ کې باید ډیری څاګانې وي، او بیولوژیکي تکرارونه باید وي.
① | خالي کنټرول | په تجربو کې د حجرو د ودې حالت معلومولو لپاره کارول کیږي |
② | منفي کنټرول siRNA (غیر مشخص siRNA ترتیب) | د RNAi عمل ځانګړتیا ښکاره کړئ.siRNA ممکن د 200nM غلظت کې غیر مشخص فشار غبرګون رامینځته کړي. |
③ | د لیږد ریجنټ کنټرول | حجرو ته د لیږدونکي ریجنټ زهرجنیت یا د هدف جین په بیان باندې تاثیر لرې کړئ |
④ | siRNA د هدف جین پروړاندې | د هدف جین بیان ټیټ کړئ |
⑤ (اختیاري) | مثبت siRNA | د تجربوي سیسټم او عملیاتي ستونزو د حل لپاره کارول کیږي |
⑥ (اختیاري) | د فلوروسینټ کنټرول siRNA | د حجرو د لیږد موثریت د مایکروسکوپ سره لیدل کیدی شي |
2.2 د پریمر ډیزاین اصول
پراخه شوې ټوټه اندازه | په غوره توګه په 100-150bp کې |
د پریمر اوږدوالی | 18-25bp |
د GC منځپانګه | 30%-70%، په غوره توګه 45%-55% |
د Tm ارزښت | 58-60℃ |
ترتیب | د دوامداره T/C څخه ډډه وکړئ؛A/G دوامداره |
3 پای ترتیب | د GC بډایه یا AT بډایه څخه ډډه وکړئ؛د ترمینل اساس په غوره توګه G یا C دی؛دا غوره ده چې د T څخه مخنیوی وشي |
بشپړتیا | د پرائمر دننه یا د دوه پرائمرونو ترمینځ د 3 څخه زیاتو اډو د تکمیلي ترتیبونو څخه ډډه وکړئ |
ځانګړتیا | د پریمر ځانګړتیا تصدیق کولو لپاره د چاودنې لټون وکاروئ |
①SiRNA د ډولونو لپاره ځانګړی دی، او د مختلفو ډولونو ترتیب به توپیر ولري.
②SiRNA په یخ وچ شوي پوډر کې بسته شوي، کوم چې د خونې په حرارت کې د 2-4 اونیو لپاره په ثابت ډول ساتل کیدی شي.
2.3 وسیلې یا ریجنټونه چې باید مخکې له مخکې چمتو شي
پرائمر (داخلي حواله) | په شمول دوه مخکی او شاته |
پرائمر (د هدف جین) | په شمول دوه مخکی او شاته |
هدف Si RNA (3 پټې) | عموما، شرکت به 3 پټې ترکیب کړي، او بیا به د RT-PCR لخوا له دریو څخه یوه غوره کړي |
د لیږد کټ | Lipo2000 etc. |
د RNA چټک استخراج کټ | د انتقال وروسته د RNA استخراج لپاره |
د چټک ریورس لیږد کټ | د cDNA ترکیب لپاره |
د PCR امپلیفیکیشن کټ | 2×سوپر SYBR شنه د qPCR ماسټر مکس |
2.4 د هغو مسلو په اړه چې باید په ځانګړو تجربوي مرحلو کې ورته پام وشي:
①siRNA د انتقال پروسه
1. د پلیټ کولو لپاره، تاسو کولی شئ 24 څاه پلیټ، 12 څاه پلیټ یا 6 څاه پلیټ غوره کړئ (د 24 څاه پلیټ په هر څاه کې د اوسط RNA غلظت وړاندیز شوی شاوخوا 100-300 ng/uL دی) او د حجرو غوره لیږد کثافت تر 60٪ یا 80٪ پورې دی.
2. د لیږد مرحلې او ځانګړي اړتیاوې په کلکه د لارښوونو سره سم دي.
3. د انتقال څخه وروسته، نمونې د 24-72 ساعتونو په اوږدو کې د mRNA کشف (RT-PCR) یا پروټین کشف لپاره په 48-96 ساعتونو کې راټول کیدی شي (WB)
② د RNA استخراج پروسه
1. د خارجي انزایمونو په واسطه د ککړتیا مخه نیسي.پدې کې په عمده ډول د ماسکونو او دستکشو اغوستل په کلکه شامل دي؛د تعقیم شوي پایپټ لارښوونو او EP ټیوبونو کارول؛هغه اوبه چې په تجربه کې کارول کیږي باید د RNase څخه پاک وي.
2. دا سپارښتنه کیږي چې د چټک استخراج په کټ کې وړاندیز شوي دوه ځله ترسره کړئ، کوم چې په حقیقت کې پاکوالی او حاصلات ښه کوي.
3. فاضله مایع باید د RNA کالم ته لاس ونلري.
③ د RNA اندازه کول
وروسته له دې چې RNA استخراج شي، دا په مستقیم ډول د Nanodrop سره اندازه کیدی شي، او لږترلږه لوستل کیدای شي د 10ng/ul په څیر ټیټ وي.
④ د نقل کولو پروسه ریورس کړئ
1. د RT-qPCR د لوړ حساسیت له امله، لږترلږه 3 موازي څاه ګانې باید د هرې نمونې لپاره جوړ شي ترڅو د راتلونکی Ct د ډیری توپیر څخه مخنیوی وشي یا د احصایوي تحلیل لپاره SD خورا لوی وي.
2. د ماسټر مخلوط په مکرر ډول کنګل او یخ مه کوئ.
3. هر ټیوب/سوري باید د نوي ټیپ سره بدل شي!د نمونو اضافه کولو لپاره په دوامداره توګه ورته پایپټ ټیپ مه کاروئ!
4. د نمونې له اضافه کولو وروسته د 96 څاه پلیټ سره تړل شوی فلم باید د پلیټ سره نرم شي.دا غوره ده چې مخکې له دې چې په ماشین کې یې واچوئ سینټرفیوج کړئ، ترڅو د ټیوب دیوال کې مایع لاندې جریان وکړي او د هوا بلبلونه لرې کړي.
⑤عام منحنی تحلیل
د لوګاریتمیک ودې موده نه ده | د نمونې احتمالي لوړ غلظت |
د CT ارزښت نشته | د فلوروسینټ سیګنالونو موندلو لپاره غلط ګامونه؛ د پرائمر یا پروبونو تخریب - د دې بشپړتیا د PAGE الیکٹروفورسیس لخوا کشف کیدی شي. د نمونې کافي اندازه؛ د نمونو تخریب - د نمونې په چمتو کولو کې د ناپاکۍ معرفي کولو او بار بار یخولو او پړسوب څخه مخنیوی؛ |
Ct> 38 | د ټیټ لوړولو موثریت؛د PCR محصول ډیر اوږد دی؛مختلف عکس العمل اجزا تخریب کیږي |
خطي امپلیفیکیشن وکر | پروبونه کیدای شي د یخ وهلو د مکرر یا د رڼا سره د اوږد مهاله تماس په واسطه په جزوي توګه تخریب شي |
د نقل شوي سوراخونو توپیر په ځانګړې توګه لوی دی | د عکس العمل محلول په بشپړه توګه نه دی منحل شوی یا د عکس العمل محلول مخلوط شوی نه دی؛د PCR وسیلې حرارتي حمام د فلوروسینټ موادو لخوا ککړ شوی |
2.5 د معلوماتو تحلیل په اړه
د qPCR ډیټا تحلیل په نسبي مقدار او مطلق مقدار ویشل کیدی شي.د مثال په توګه، د درملنې ګروپ کې حجرې د کنټرول ګروپ کې د حجرو سره پرتله کیږي،
د ایکس جین mRNA څو ځله بدلیږي، دا نسبتا اندازه ده؛په یو ټاکلی شمیر حجرو کې، د ایکس جین mRNA
څومره نقلونه شتون لري، دا مطلق مقدار دی.معمولا هغه څه چې موږ یې په لابراتوار کې ډیر کاروو د نسبي کمیت میتود دی.معمولا،د 2-ΔΔct طریقهپه تجربو کې خورا کارول کیږي، نو یوازې دا طریقه به دلته په تفصیل سره معرفي شي.
2-ΔΔct میتود: ترلاسه شوې پایله د کنټرول ګروپ کې د هدف جین په پرتله په تجربوي ګروپ کې د هدف جین څرګندولو کې توپیر دی.دا اړینه ده چې د هدف جین او داخلي حوالې جین دواړه د لوړولو وړتیاوې 100٪ ته نږدې وي، او نسبي انحراف باید له 5٪ څخه ډیر نه وي.
د محاسبې طریقه په لاندې ډول ده:
Δct کنټرول ګروپ = په کنټرول ګروپ کې د هدف جین ct ارزښت - په کنټرول ګروپ کې د داخلي حوالې جین ct ارزښت
Δct تجرباتي ګروپ = په تجربوي ګروپ کې د هدف جین ct ارزښت - په تجربه لرونکي ګروپ کې د داخلي حوالې جین ct ارزښت
ΔΔct=Δct تجربوي ګروپ-Δct کنټرول ګروپ
په نهایت کې، د بیان په کچه کې د توپیر ګڼ شمیر محاسبه کړئ:
فولډ = 2-ΔΔct بدل کړئ (د ایکسل فنکشن سره مطابقت لري پاور دی)
اړوند توليدات:
د پوسټ وخت: می-20-2023