1. اساسي پوهه (که تاسو غواړئ تجربه برخه وګورئ، مهرباني وکړئ مستقیم دویمې برخې ته انتقال کړئ)

د دودیز PCR د مشتق عکس العمل په توګه ، د ریښتیني وخت PCR په عمده توګه د PCR امپلیفیکیشن عکس العمل په هر دور کې د فلوروسینس سیګنال بدلون له لارې په ریښتیني وخت کې د امپلیفیکیشن محصول مقدار بدلوي ، او د ct ارزښت او معیاري وکر ترمینځ اړیکې له لارې د پیل شوي ټیمپلیټ مقدار تحلیل کوي.

د RT-PCR مشخص معلومات دياساسی کرښه, د فلوروسینس حداود Ct ارزښت.

د RT-PCR لپاره د لیبل کولو عام میتودونه:

2. تجربوي ګامونه

2.1 د تجربې ګروپ کولو په اړه- په ګروپ کې باید ډیری څاګانې وي، او بیولوژیکي تکرارونه باید وي.

2.2 د پریمر ډیزاین اصول

①SiRNA د ډولونو لپاره ځانګړی دی، او د مختلفو ډولونو ترتیب به توپیر ولري.

②SiRNA په یخ وچ شوي پوډر کې بسته شوي، کوم چې د خونې په حرارت کې د 2-4 اونیو لپاره په ثابت ډول ساتل کیدی شي.

2.3 وسیلې یا ریجنټونه چې باید مخکې له مخکې چمتو شي

2.4 د هغو مسلو په اړه چې باید په ځانګړو تجربوي مرحلو کې ورته پام وشي:

①siRNA د انتقال پروسه

1. د پلیټ کولو لپاره، تاسو کولی شئ 24 څاه پلیټ، 12 څاه پلیټ یا 6 څاه پلیټ غوره کړئ (د 24 څاه پلیټ په هر څاه کې د اوسط RNA غلظت وړاندیز شوی شاوخوا 100-300 ng/uL دی) او د حجرو غوره لیږد کثافت تر 60٪ یا 80٪ پورې دی.

2. د لیږد مرحلې او ځانګړي اړتیاوې په کلکه د لارښوونو سره سم دي.

3. د انتقال څخه وروسته، نمونې د 24-72 ساعتونو په اوږدو کې د mRNA کشف (RT-PCR) یا پروټین کشف لپاره په 48-96 ساعتونو کې راټول کیدی شي (WB)

② د RNA استخراج پروسه

1. د خارجي انزایمونو په واسطه د ککړتیا مخه نیسي.پدې کې په عمده ډول د ماسکونو او دستکشو اغوستل په کلکه شامل دي؛د تعقیم شوي پایپټ لارښوونو او EP ټیوبونو کارول؛هغه اوبه چې په تجربه کې کارول کیږي باید د RNase څخه پاک وي.

2. دا سپارښتنه کیږي چې د چټک استخراج په کټ کې وړاندیز شوي دوه ځله ترسره کړئ، کوم چې په حقیقت کې پاکوالی او حاصلات ښه کوي.

3. فاضله مایع باید د RNA کالم ته لاس ونلري.

③ د RNA اندازه کول

وروسته له دې چې RNA استخراج شي، دا په مستقیم ډول د Nanodrop سره اندازه کیدی شي، او لږترلږه لوستل کیدای شي د 10ng/ul په څیر ټیټ وي.

④ د نقل کولو پروسه ریورس کړئ

1. د RT-qPCR د لوړ حساسیت له امله، لږترلږه 3 موازي څاه ګانې باید د هرې نمونې لپاره جوړ شي ترڅو د راتلونکی Ct د ډیری توپیر څخه مخنیوی وشي یا د احصایوي تحلیل لپاره SD خورا لوی وي.

2. د ماسټر مخلوط په مکرر ډول کنګل او یخ مه کوئ.

3. هر ټیوب/سوري باید د نوي ټیپ سره بدل شي!د نمونو اضافه کولو لپاره په دوامداره توګه ورته پایپټ ټیپ مه کاروئ!

4. د نمونې له اضافه کولو وروسته د 96 څاه پلیټ سره تړل شوی فلم باید د پلیټ سره نرم شي.دا غوره ده چې مخکې له دې چې په ماشین کې یې واچوئ سینټرفیوج کړئ، ترڅو د ټیوب دیوال کې مایع لاندې جریان وکړي او د هوا بلبلونه لرې کړي.

⑤عام منحنی تحلیل

2.5 د معلوماتو تحلیل په اړه

د qPCR ډیټا تحلیل په نسبي مقدار او مطلق مقدار ویشل کیدی شي.د مثال په توګه، د درملنې ګروپ کې حجرې د کنټرول ګروپ کې د حجرو سره پرتله کیږي،

د ایکس جین mRNA څو ځله بدلیږي، دا نسبتا اندازه ده؛په یو ټاکلی شمیر حجرو کې، د ایکس جین mRNA

څومره نقلونه شتون لري، دا مطلق مقدار دی.معمولا هغه څه چې موږ یې په لابراتوار کې ډیر کاروو د نسبي کمیت میتود دی.معمولا،د 2-ΔΔct طریقهپه تجربو کې خورا کارول کیږي، نو یوازې دا طریقه به دلته په تفصیل سره معرفي شي.

2-ΔΔct میتود: ترلاسه شوې پایله د کنټرول ګروپ کې د هدف جین په پرتله په تجربوي ګروپ کې د هدف جین څرګندولو کې توپیر دی.دا اړینه ده چې د هدف جین او داخلي حوالې جین دواړه د لوړولو وړتیاوې 100٪ ته نږدې وي، او نسبي انحراف باید له 5٪ څخه ډیر نه وي.

د محاسبې طریقه په لاندې ډول ده:

Δct کنټرول ګروپ = په کنټرول ګروپ کې د هدف جین ct ارزښت - په کنټرول ګروپ کې د داخلي حوالې جین ct ارزښت

Δct تجرباتي ګروپ = په تجربوي ګروپ کې د هدف جین ct ارزښت - په تجربه لرونکي ګروپ کې د داخلي حوالې جین ct ارزښت

ΔΔct=Δct تجربوي ګروپ-Δct کنټرول ګروپ

په نهایت کې، د بیان په کچه کې د توپیر ګڼ شمیر محاسبه کړئ:

فولډ = 2-ΔΔct بدل کړئ (د ایکسل فنکشن سره مطابقت لري پاور دی)

اړوند توليدات:

د سیل مستقیم RT-qPCR کټ