د پیل مواد: RNA
د کمیتي ریورس ټرانسکرپشن PCR (RT-qPCR) یو تجرباتي میتود دی چې د PCR تجربو کې کارول کیږي RNA د پیل شوي موادو په توګه کارول کیږي.په دې طریقه کې، ټول RNA یا رسول RNA (mRNA) لومړی په بشپړونکي DNA (cDNA) کې د ریورس ټرانسکریټیس په واسطه لیږدول کیږي.وروسته، د qPCR عکس العمل د cDNA په کارولو سره د نمونې په توګه ترسره شو.RT-qPCR په مختلفو مالیکولر بیولوژی غوښتنلیکونو کې کارول شوی، پشمول د جین بیان تحلیل، د RNA مداخله تایید، د مایکروری تصدیق، د رنځجن کشف، جینیاتي ازموینې، او د ناروغۍ څیړنې.
د RT-qPCR لپاره یو ګام او دوه مرحلې میتودونه
RT-qPCR د یو ګام یا دوه مرحلې میتود لخوا ترسره کیدی شي.یو ګام RT-qPCR د ریورس ټرانسکرپشن او PCR امپلیفیکیشن سره یوځای کوي، د ریورس ټرانسکریټیس او DNA پولیمریز ته اجازه ورکوي چې په ورته ټیوب کې د ورته بفر شرایطو لاندې عکس العمل بشپړ کړي.یو ګام RT-qPCR یوازې د ترتیب ځانګړي پریمر کارولو ته اړتیا لري.په دوه مرحلو RT-qPCR کې، ریورس ټرانسکرپشن او PCR امپلیفیکیشن په دوه ټیوبونو کې ترسره کیږي، د مختلف مطلوب بفرونو، غبرګون شرایطو، او د پریمر ډیزاین ستراتیژیو په کارولو سره.
| ګټه | نیمګړتیا | |
| یو ګام | دا طریقه لږ تجربه لرونکي تېروتنه لري ځکه چې دواړه غبرګونونه په یوه ټیوب کې ترسره کیږي
د پایپ کولو لږ ګامونه د ککړتیا خطر کموي
د لوړې کچې لوړولو / سکرینینګ لپاره مناسب ، ګړندی او د تولید وړ | دوه مرحلې عکس العملونه په جلا توګه مطلوب نشي کیدی
څرنګه چې د عکس العمل شرایط د دوه مرحلې عکس العمل په یوځای کولو سره موافقت کیږي، حساسیت د دوه مرحلو میتود په څیر ښه ندی.
د یوې نمونې لخوا کشف شوي اهدافو شمیر لږ دی |
| دوه ګامونه | د مستحکم cDNA کتابتونونو رامینځته کولو وړتیا چې د اوږدې مودې لپاره زیرمه کیدی شي او په ډیری عکس العملونو کې کارول کیدی شي
هدف جینونه او د حوالې جینونه د ورته cDNA کتابتون څخه پرته د څو cDNA کتابتونونو ته اړتیا پرته پراخه کیدی شي
د عکس العمل بفرونه او د عکس العمل شرایط چې د واحد عکس العمل چلولو اصلاح کول فعالوي
د محرک شرایطو انعطاف وړ انتخاب | د ډیری ټیوبونو کارول، او د پایپ کولو ډیر ګامونه د DNA ککړتیا خطر زیاتوي، او وخت مصرفوي.
د یو ګام میتود په پرتله ډیر اصلاح ته اړتیا لري |
اړوند توليدات:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (یو ګام)-SYBR شنه I
RT Easyᴹ I Master Premix for First Strand CDNA ترکیب
د ریښتیني وخت PCR Easyᵀᴹ-SYBR شنه I کټ
د ریښتیني وخت PCR Easyᵀᴹ - Taqman
د ټول RNA او mRNA انتخاب
کله چې د RT-qPCR تجربه ډیزاین کړئ، نو دا مهمه ده چې پریکړه وکړو چې آیا ټول RNA یا پاک شوي mRNA د ریورس لیږد لپاره د ټیمپلیټ په توګه وکاروئ.که څه هم mRNA کیدای شي یو څه لوړ حساسیت چمتو کړي، ټول RNA لاهم په مکرر ډول کارول کیږي.د دې دلیل دا دی چې ټول RNA د mRNA په پرتله د پیل شوي موادو په توګه خورا مهم ګټه لري.لومړی، پروسه د پاکولو لږو ګامونو ته اړتیا لري، کوم چې د ټیمپلیټ ښه کمیتي بیا رغونه او د حجرو شمیرو پیل کولو لپاره د پایلو ښه نورمال کول تضمینوي.دوهم، دا د mRNA بډایه کولو مرحلې څخه مخنیوی کوي، کوم چې کولی شي د مختلفو mRNAs د بیا رغونې له امله د خرابو پایلو احتمال څخه مخنیوی وکړي.په ټولیز ډول، ځکه چې په ډیری غوښتنلیکونو کې د هدف جین نسبي مقدار د کشف د مطلق حساسیت څخه ډیر مهم دی، ټول RNA په ډیری قضیو کې ډیر مناسب دی.
د نقل نقل پریمر ریورس کړئ
په دوه مرحلې میتود کې، درې مختلف میتودونه د cDNA عکس العمل اصلي کولو لپاره کارول کیدی شي: اولیګو (dT) پریمیرونه، تصادفي پریمرونه، یا د ترتیب ځانګړي پرائمرونه.عموما، اولیګو (dT) پریمرونه او تصادفي پریمرونه په ترکیب کې کارول کیږي.دا پرائمرونه د mRNA strand سره anneal کوي او د ترکیب لپاره د پیل ټکي سره ریورس ټرانسکریټیز چمتو کوي.
| د پریمر انتخاب | جوړښت او فعالیت | ګټه | نیمګړتیا |
| اولیګو (dT) پریمر (یا لنگر شوی اولیګو (dT) پریمر) | د mRNA په پولی (A) دم کې د تایمین پاتې شونو ته غځول شوی انیل کول؛اینکر اولیګو (dT) پریمر د 3′ پای کې G، C، یا A لري (د لنگر سایټ) | د پولی (A) tailed mRNA څخه د بشپړ اوږدوالی cDNA ترکیب
د تطبیق وړ کله چې لږ پیل شوي مواد شتون ولري
د لنگر کولو سایټ ډاډ ترلاسه کوي چې oligo(dT) پریمر د mRNA 5′ پولی (A) دم سره تړلی دی | یوازې د پولی (A) لکۍ سره د جینونو پراخولو لپاره مناسب دی
په پولی (A) کې د اصلي سایټ * 2 څخه قطع شوي cDNA ترلاسه کړئ
د 3′ پای ته تړلو لپاره تعصب*
* دا امکان کمیږي که چیرې لنگر شوي اولیګو (dT) پریمرونه وکارول شي |
| تصادفي پریمر
| په اوږدوالي کې له 6 څخه تر 9 پورې اډې، کوم چې کولی شي د RNA لیږد په جریان کې ډیری سایټونو ته وصل شي | د ټولو RNAs (tRNA، rRNA، او mRNA) سره نښلول
د پام وړ ثانوي جوړښت سره د لیږد لپاره مناسب، یا کله چې لږ پیل شوي مواد شتون ولري
د لوړ cDNA حاصل | cDNA د ټولو RNA څخه برعکس نقل شوی ، کوم چې معمولا مطلوب نه وي او ممکن د هدف mRNA سیګنال ضعیف کړي.
کم شوی cDNA ترلاسه کړئ |
| د ترتیب ځانګړي پریمرونه | ګمرکي پرائمرونه د ځانګړو mRNA سلسلې په نښه کوي | ځانګړی cDNA کتابتون
حساسیت ښه کړئ
د ریورس QPCR پریمرونو کارول | یوازې د یو واحد هدف جین ترکیب پورې محدود دی |
د ټرانسکریپټیس برعکس
Reverse transscriptase یو انزایم دی چې د DNA ترکیب لپاره RNA کاروي.ځینې ریورس ټرانسکریټسونه د RNase فعالیت لري او کولی شي د لیږد وروسته RNA-DNA هایبرډ سټینډونو کې د RNA سټینډونه خراب کړي.که چیرې دا د RNase انزیماتیک فعالیت ونه لري، RNaseH د لوړ qPCR موثریت لپاره اضافه کیدی شي.په عام ډول کارول شوي انزایمونه د مولوني مورین لیوکیمیا ویروس ریورس ټرانسکریټیس او د ایویان میلوبلاسټوما ویروس ریورس ټرانسکریټیس شامل دي.د RT-qPCR لپاره، دا غوره ده چې د لوړې تودوخې سره ریورس ټرانسکریپټیس غوره کړئ، ترڅو د cDNA ترکیب په لوړه تودوخه کې ترسره شي، د RNAs بریالي لیږد یقیني کول د لوړ ثانوي جوړښت سره، پداسې حال کې چې د عکس العمل په اوږدو کې د دوی بشپړ فعالیت ساتل کیږي، په پایله کې د لوړ cDNA حاصلات.
اړوند توليدات:
Foreasy M-MLV Reverse Transscriptase
د ریورس ټرانسکریټیس RNase H فعالیت
RNaseH د دې وړتیا لري چې د RNA-DNA ډوپلیکسونو څخه د RNA سټینډونه تخریب کړي ، د دوه اړخیزه DNA موثر ترکیب ته اجازه ورکوي.په هرصورت، کله چې اوږده mRNA د یوې نمونې په توګه کارول کیږي، RNA کیدای شي د وخت څخه مخکې تخریب شي، چې پایله یې د cDNA ټوټه شوې.نو ځکه، دا ډیری وخت ګټور دی چې د RNaseH فعالیت د cDNA کلونینګ په جریان کې کم کړئ که چیرې د اوږد لیږد ترکیب مطلوب وي.برعکس، د RNase H فعالیت سره ریورس لیږدونه اکثرا د qPCR غوښتنلیکونو لپاره ګټور دي ځکه چې دوی د PCR د لومړي دورې په جریان کې د RNA-DNA ډوپلیکسونو خټکي ته وده ورکوي.
د پریمر ډیزاین
د PCR پرائمرونه چې په RT-qPCR کې د qPCR مرحلې لپاره کارول کیږي باید په مثالي ډول د Exon-exon جنکشن پراخولو لپاره ډیزاین شي، چیرې چې د امپلیفیکیشن پریمر په احتمالي توګه د ریښتیني Exon-Intro حدود پراخولی شي.څرنګه چې د انټرون لرونکي جینومیک DNA سلسلې پراخې شوي ندي، نو دا ډیزاین د جینومیک DNA د ککړتیا څخه د پراخ شوي غلط مثبت خطر کموي.
که چیرې پریمرونه د Exons یا exon-exon حدود جلا کولو لپاره ډیزاین نشي، نو دا به اړین وي چې د RNA نمونې د RNase-free DNase I یا dsDNase سره درملنه وشي ترڅو د جینومیک DNA ککړتیا لرې کړي.
RT-qPCR کنټرول
د ریورس لیږد منفي کنټرول (-RT کنټرول) باید د RT-qPCR په ټولو تجربو کې شامل شي ترڅو د DNA ککړتیا کشف کړي (لکه د پخوانیو عکس العملونو څخه جینومیک DNA یا PCR محصولات).دا کنټرول د عکس العمل ټول اجزا لري پرته له ریورس ټرانسکریټیس.څرنګه چې د دې کنټرول سره ریورس لیږد نه پیښیږي، که چیرې د PCR پراخوالی لیدل کیږي، د DNA څخه ککړتیا خورا احتمال لري.
د پوسټ وخت: اګست-02-2022
