• PCR هغه طریقه ده چې د DNA د یوې کوچنۍ اندازې څخه د DNA پراخولو لپاره کارول کیږي.RT-PCR د RNA سرچینې څخه د DNA ټیمپلیټ تولید لپاره ریورس لیږد کاروي چې بیا پراخ کیدی شي.
• PCR او RT-PCR عموما د پای ټکي تعاملات دي، پداسې حال کې چې qPCR او RT-qPCR د PCR عکس العمل په جریان کې د محصول ترکیب د نرخ متحرکات کاروي ترڅو د موجوده نمونې مقدار اندازه کړي.
• نوي میتودونه، لکه ډیجیټل PCR، د لومړني DNA ټیمپلیټ مطلق مقدار چمتو کوي، پداسې حال کې چې میتودونه لکه isothermal PCR د باور وړ پایلو چمتو کولو لپاره د ګران تجهیزاتو اړتیا کموي.

د پولیمیریز چین عکس العمل (PCR) نسبتا ساده او په پراخه کچه کارول شوي مالیکولر بیولوژي تخنیک دی چې د DNA او RNA سلسلې پراخه او کشف کوي.د DNA کلونینګ او امپلیفیکیشن دودیزو میتودونو په پرتله ، کوم چې ډیری وختونه ورځې نیسي ، PCR یوازې څو ساعتونو ته اړتیا لري.PCR خورا حساس دی او د ځانګړو ترتیبونو کشف او پراخولو لپاره لږترلږه ټیمپلیټ ته اړتیا لري.د PCR بنسټیز میتودونه د ساده DNA او RNA کشف څخه نور هم پرمختللي دي.لاندې، موږ ستاسو د څیړنې اړتیاو لپاره د مختلف PCR میتودونو او ریجنټونو یوه عمومي کتنه چمتو کړې چې موږ یې په Enzo Life Sciences کې چمتو کوو.موږ هدف لرو چې ساینس پوهانو سره مرسته وکړو چې ژر تر ژره د PCR ریجنټونو ته لاسرسی ومومي ترڅو د دوی راتلونکي څیړنې پروژه کې وکاروي!

PCR

د معیاري PCR لپاره، تاسو ټول هغه څه ته اړتیا لرئ چې د DNA پولیمریز، مګنیزیم، نیوکلیوټایډز، پرائمر، د DNA ټیمپلیټ چې پراخ شي، او یو ترموسایکلر.د PCR میکانیزم د خپل هدف په څیر ساده دی: 1) دوه اړخیزه DNA (dsDNA) د تودوخې له مینځه وړل کیږي، 2) پرائمرونه د واحد DNA سټینډونو سره سمون لري، او 3) پرائمرونه د DNA پولیمریز په واسطه پراخ شوي، چې په پایله کې یې دوه کاپي شوي. اصلي DNA سټنډ.د تودوخې او وختونو په لړۍ کې د ډینیټوریشن، اینیل کولو، او اوږدیدو پروسه د امپلیفیکیشن د یوې دورې په توګه پیژندل کیږي (1 شکل).

د دورې هر پړاو باید د کارول شوي ټیمپلیټ او پریمر سیټ لپاره مطلوب وي.دا دوره شاوخوا 20-40 ځله تکرار کیږي، او بیا پراخ شوی محصول په ځانګړي ډول د اګرز جیل (2 شکل) لخوا تحلیل کیدی شي.

لکه څنګه چې PCR خورا حساس میتود دی او د واحد عکس العملونو لپاره خورا کوچني حجمونو ته اړتیا ده ، نو د څو عکس العملونو لپاره د ماسټر مکس چمتو کولو سپارښتنه کیږي.ماسټر مکس باید ښه مخلوط شي او بیا د عکس العملونو شمیر سره ویشل شي، دا ډاډ ترلاسه کوي چې هر عکس العمل به ورته مقدار انزایم، dNTPs، او پریمر ولري.ډیری عرضه کونکي، لکه د انزو لایف ساینس، د PCR مکسونه هم وړاندې کوي چې دمخه د پریمرونو او DNA ټیمپلیټ پرته هرڅه لري.

ګوانین/سایټوسین بډایه (GC-بډایه) سیمې د معیاري PCR تخنیکونو کې ننګونه وړاندې کوي.د GC بډایه ترتیبونه د هغو ترتیبونو په پرتله چې د ټیټ GC مینځپانګې سره ډیر مستحکم دي.برسېره پردې، د GC بډایه ترتیبونه د ثانوي جوړښتونو لکه د ویښتو لوپونه جوړوي.د پایلې په توګه، د GC بډایه ډبل سټینډونه د ډینیټوریشن مرحله کې په بشپړ ډول جلا کول ستونزمن دي.په پایله کې، DNA پولیمیریز نشي کولی پرته له خنډ څخه نوی سټینډ ترکیب کړي.د لوړې تودوخې تودوخه کولی شي دا ښه کړي، او د لوړ انیل کولو تودوخې او د لنډ انیل کولو وخت لپاره تنظیمات کولی شي د GC بډایه پریمرونو غیر مشخص پابندۍ مخه ونیسي.اضافي ریجنټونه کولی شي د GC بډایه ترتیبونو پراخولو ته وده ورکړي.DMSO، ګلیسرول، او بیټین د ثانوي جوړښتونو ګډوډولو کې مرسته کوي کوم چې د GC تعاملاتو له امله رامینځته کیږي او په دې توګه د ډبل سټینډونو جلا کول اسانه کوي.

ګرم پیل PCR

غیر مشخص پراخوالی یوه ستونزه ده چې د PCR په جریان کې پیښ کیدی شي.ډیری DNA پولیمیریزونه چې د PCR لپاره کارول کیږي د 68 ° C څخه تر 72 ° C شاوخوا تودوخې کې غوره کار کوي.په هرصورت، انزایم کولی شي په ټیټ حرارت کې هم فعال وي، که څه هم په ټیټه درجه کې.د انیل کولو تودوخې څخه خورا ټیټه تودوخې کې، پریمرونه په غیر مشخص ډول تړل کیدی شي او د غیر مشخص پراخوالي لامل کیږي، حتی که عکس العمل په یخ کې تنظیم شوی وي.دا د پولیمیریز مخنیوی کونکو په کارولو سره مخنیوی کیدی شي چې د DNA پولیمیریز څخه یوازې یوځل جلا کیږي کله چې یوې ټاکلې تودوخې ته ورسیږي ، له همدې امله د ګرم پیل PCR اصطلاح.مخنیوی کوونکی کیدای شي یو انټي باډي وي چې پولیمیریز او ډینیچرونه په ابتدایي تودوخې (95 ° C معمولا) کې وتړي.

د لوړ وفاداري پولیمیریز

پداسې حال کې چې د DNA پولیمیریزونه د اصلي ټیمپلیټ ترتیب ته په کافي اندازه په سمه توګه وده ورکوي، د نیوکلیوټایډ په سمون کې غلطۍ واقع کیدی شي.په اپلیکیشنونو کې بې سمونې لکه کلونینګ کولی شي د لنډ شوي نقلونو پایله ولري ، او غلط ژباړل شوي یا غیر فعال پروټینونه لاندې جریان لري.د دې بې اتفاقۍ څخه مخنیوي لپاره، د "ثبوت لوستل" فعالیت سره پولیمریزونه پیژندل شوي او د کار په جریان کې شامل شوي.لومړی پروفریډینګ پولیمریز، Pfu، په 1991 کې په Pyrococcus furiosus کې وپیژندل شو.دا Pfu انزایم د 3' څخه تر 5' exonuclease فعالیت لري.لکه څنګه چې DNA پراخ شوی دی، exonuclease د 3 په پای کې د 3' په پای کې نا برابر نیوکلیوټایډونه لرې کوي.سم نیوکلیوټایډ بیا ځای په ځای کیږي، او د DNA ترکیب دوام لري.د غلط نیوکلیوټایډ ترتیبونو پیژندنه د انزایم سره د سم نیوکلیوسایډ ټرایفاسفیټ لپاره د پابند تړاو پراساس ده ، چیرې چې غیر موثر پابند کول ترکیب ورو کوي او د سم ځای په ځای کولو اجازه ورکوي.د Pfu پولیمیریز پروف ریډینګ فعالیت په وروستي ترتیب کې د Taq DNA پولیمیریز په پرتله لږې تېروتنې پایله لري.په دې وروستیو کلونو کې، د پروف ریډینګ نور انزایمونه پیژندل شوي، او د اصلي Pfu انزایمونو تعدیلات د DNA امپلیفیکیشن په جریان کې د غلطۍ کچه نوره هم کمه کړې.

RT-PCR

د ریورس ټرانسکرپشن PCR، یا RT-PCR، د یوې نمونې په توګه د RNA کارولو ته اجازه ورکوي.یو اضافي ګام د RNA کشف او پراخولو ته اجازه ورکوي.RNA د ریورس ټرانسکریپټیس په کارولو سره په تکمیلي DNA (cDNA) کې برعکس لیکل کیږي.د RNA ټیمپلیټ کیفیت او پاکوالی د RT-PCR بریالیتوب لپاره اړین دي.د RT-PCR لومړی ګام د DNA/RNA هایبرډ ترکیب دی.Reverse transcriptase هم د RNase H فعالیت لري، کوم چې د هایبرډ RNA برخه خرابوي.یو واحد ډنډ شوی DNA مالیکول بیا د DNA پورې تړلي DNA پولیمیریز فعالیت لخوا په cDNA کې د ریورس ټرانسکریپټیس بشپړیږي.د لومړي سټینډ عکس العمل موثریت کولی شي د لوړولو پروسه اغیزه وکړي.له دې ځایه، د معیاري PCR طرزالعمل د cDNA پراخولو لپاره کارول کیږي.د RT-PCR لخوا د RNA په cDNA کې د بیرته راګرځولو امکان ډیری ګټې لري، او دا په ابتدايي توګه د جین بیان تحلیل لپاره کارول کیږي.RNA یوازینی او ډیر بې ثباته دی، کوم چې دا کار کول ستونزمن کوي.دا عموما په qPCR کې د لومړي ګام په توګه کار کوي، کوم چې په بیولوژیکي نمونه کې د RNA لیږد اندازه کوي.

qPCR او RT-qPCR

مقداری PCR (qPCR) د ډیری غوښتنلیکونو لپاره د نیوکلیک اسیدونو کشف ، مشخص کولو او مقدار کولو لپاره کارول کیږي.په RT-qPCR کې، د RNA ټرانسکریپټونه اکثرا د بیرته راګرځولو له لارې اندازه کیږي لومړی په cDNA کې، لکه څنګه چې پورته تشریح شوي، او بیا وروسته qPCR ترسره کیږي.لکه څنګه چې په معیاري PCR کې، DNA د دریو تکراري ګامونو لخوا پراخ شوی: ډینیټوریشن، انیل کول، او اوږدوالی.په هرصورت، په qPCR کې، فلوروسینټ لیبل کول د معلوماتو راټولولو توان ورکوي لکه څنګه چې PCR پرمختګ کوي.دا تخنیک د ډیری میتودونو او کیمیاوي میتودونو له امله ډیری ګټې لري.

د رنګ پر بنسټ qPCR (عموما شنه) کې، د فلوروسینټ لیبل کول د dsDNA پابند رنګ په کارولو سره د لوړ شوي DNA مالیکولونو اندازه کولو ته اجازه ورکوي.د هر دورې په جریان کې، فلوروسینس اندازه کیږي.د فلوروسینس سیګنال د نقل شوي DNA مقدار سره متناسب وده کوي.له همدې امله، DNA په "ریښتیني وخت" کې اندازه کیږي (3 انځور).د رنګ پر بنسټ د qPCR زیانونه دا دي چې یوازې یو هدف په یو وخت کې معاینه کیدی شي او دا چې رنګ به په نمونه کې موجود هر ډول ds-DNA پورې تړلی وي.

د پروب پر بنسټ qPCR کې، په هره نمونه کې ډیری هدفونه په یو وخت کې کشف کیدی شي، مګر دا د پرائمرونو سربیره کارول شوي هدف مشخص تحقیقاتو اصلاح او ډیزاین ته اړتیا لري.د تحقیقاتو ډیزاین ډیری ډولونه شتون لري، مګر ترټولو عام ډول د هایدرولیسس تحقیقات دی، کوم چې فلوروفور او quencher لري.د فلوروسینس ریزونانس انرژي لیږد (FRET) د quencher له لارې د فلوروفور د اخراج مخه نیسي پداسې حال کې چې تحقیقات ثابت وي.په هرصورت، د PCR عکس العمل په جریان کې، تحقیقات د پریمر توسیع او د ځانګړي ترتیب پراخولو په جریان کې هایدرولیس کیږي چې دا پابند وي.د تحقیقاتو تفاوت فلوروفور له قویونکي څخه جلا کوي او په پایله کې د فلوروسینس د پراخوالي پورې تړلي زیاتوالی رامینځته کوي (4 شکل).په دې توګه، د تحقیقاتو پر بنسټ د qPCR عکس العمل څخه د فلوروسینس سیګنال په نمونه کې د شتون د پلټنې هدف ترتیب مقدار سره متناسب دی.ځکه چې د تحقیقاتو پر بنسټ qPCR د رنګ پر بنسټ د qPCR په پرتله خورا مشخص دی، دا ډیری وختونه د qPCR پر بنسټ تشخیصي ارزونو کې کارول کیږي.

Isothermal Amplification

PCR پورته ذکر شوي تخنیکونه ګران ترموسایکلینګ تجهیزاتو ته اړتیا لري ترڅو د ډینیټوریشن ، اینیلینګ او توسیع مرحلو لپاره د چیمبر تودوخې په دقیق ډول پورته او ښکته کړي.یو شمیر تخنیکونه رامینځته شوي چې ورته دقیقو وسیلو ته اړتیا نلري او د اوبو په ساده حمام کې یا حتی د ګټو حجرو کې ترسره کیدی شي.دا تخنیکونه په ټولیز ډول د isothermal amplification په نوم یادیږي او د exponential، linear، یا cascade amplification پر بنسټ کار کوي.

د isothermal amplification ترټولو مشهور ډول د لوپ منځګړیتوب isothermal amplification یا LAMP دی.LAMP په 65⁰C کې د تودوخې لوړولو څخه کار اخلي ترڅو د ټیمپلیټ DNA یا RNA پراخ کړي.کله چې د LAMP ترسره کول، د هدف DNA ساحو ته د څلورو څخه تر شپږو پرائمرونو بشپړونکي د DNA پولیمیریز سره د نوي DNA ترکیب لپاره کارول کیږي.د دې پرائمرونو څخه دوه د تعامل ترتیبونه لري چې په نورو پریمرونو کې ترتیبونه پیژني او دوی یې وتړي، د "لوپ" جوړښت ته اجازه ورکوي چې په نوي ترکیب شوي DNA کې رامینځته شي چې بیا د امپلیفیکیشن په راتلونکو پړاوونو کې د پریمر انیل کولو سره مرسته کوي.LAMP د ډیری میتودونو په واسطه لیدل کیدی شي، پشمول د فلوروسینس، اګرز جیل الیکٹروفورسیس، یا رنګومیتري.د رنګ میټری په واسطه د محصول د شتون یا نشتوالي لید او موندلو اسانتیا او د اړتیا وړ قیمتي تجهیزاتو نشتوالي LAMP په هغه سیمو کې د SARS-CoV-2 ازموینې لپاره مناسب انتخاب رامینځته کړی چیرې چې کلینیکي لابراتوار ازموینې په اسانۍ سره شتون نلري ، یا د نمونو ذخیره کول او لیږدونې. د امکان وړ نه و، یا په لابراتوارونو کې چې مخکې د PCR ترموسایکل تجهیزات نه درلودل.