هرڅوک د qRT-PCR تجربې اصولو په اړه خبرې کوي، د پریمر ډیزاین، د پایلو تشریح او نور، مګر زه فکر کوم چې زه باید تاسو سره د qRT-PCR تجربوي عملیات شریک کړم.دا کوچنی دی، مګر دا د پایلو په اړه دی.
د QRT-PCR کولو دمخه، موږ باید د خپل RNA او عملیاتي میتودونو روښانه پوهه ولرو.په پای کې، زموږ هڅې یوازې د تمرین کولو پر ځای د پایلو ترلاسه کول دي.نو د qRT-PCR کولو دمخه، موږ باید لاندې مسلې وټاکو (چې ځینې یې یوازې په SYBR کې پلي کیږي).
1 ایا تاسو ډاډه یاست چې ستاسو RNA خراب شوی نه دی؟
NanoDrop 2000 کولی شي یوازې د RNA غلظت او پاکوالي کشف کړي ، مګر نشي کولی د RNA بشپړتیا کشف کړي.
د RNA (RNA Intesity Number) ارزښت کولی شي د RNA بشپړتیا منعکس کړي، کوم چې د Agilent 2100 Bioanalyzer سیسټم لخوا کشف شوی.
شکل. د مختلفو RNA نمونو لپاره د RIN ارزښتونو سکیماتیک ډیاګرام (eukaryotes)
په هرصورت، لابراتوارونه عموما Agilent 2100 Bioanalyzer نلري.پدې حالت کې ، موږ کولی شو د formaldehyde جیل له لارې کشف کړو ، مګر د RNA ټول مقدار لپاره اړتیا لوړه ده ، نو ترټولو ګړندۍ میتود د عادي جیل الیکٹروفورسیس کارول دي.دا اړینه ده چې د نیوکلیز څخه پاک چاپیریال کې وي، نو دا اړینه ده چې د DEPC اوبو سره د الکتروفوریسس ټانک، د سول بوتل، جیل بریکٹ او کنگھه ومینځل شي.اګرز هم د نیوکلیز څخه پاک دی (تر هغه چې تازه خلاص شوی وي) ، او د بار کولو بفر باید د 1.2٪ جیل سره د امکان تر حده تازه خلاص شي.
په یاد ولرئ چې جیل باید په بشپړ ډول منحل شي، که نه نو دا به د غیر همجنسي بانډونو لامل شي، لکه څنګه چې په 9 نمونه کې ښودل شوي.که ولتاژ ډیر لوړ وي یا د ډیر وخت لپاره چلول به تودوخه تولید کړي او د RNA تخریب لامل شي ، نو ولټاژ او وخت باید په مناسب ډول کنټرول شي.برسېره پردې، د جیل چلول کولی شي نور هم معلومه کړي چې آیا په نمونه کې د DNA پاتې شوني شتون لري، او وګورئ چې ایا د توزیع کولو څاه کې د ساتل شوي بینډونو لوی شمیر شتون لري.
شکل.جیل الیکٹروفورسس د RNA کشف
2 ایا تاسو د خپل cDNA غلظت په اړه ډاډه یاست؟
په لابراتوار کې د لویو وروڼو تجربه دا ده چې د 20 ul سیسټم cDNA په مستقیم ډول د 20X په واسطه ترلاسه کیږي، پداسې حال کې چې د دوکتورا وروسته خویندې 10X کم شوي.زه معمولا په وضعیت پورې اړه لرم.ځکه چې د هر شخص لخوا ذکر شوي RNA کیفیت توپیر لري، د بیرته راګرځولو کچه هم توپیر لري، او د بیرته راګرځولو ټیکنالوژي ممکن ثبات نه وي.
نو هرکله چې زه بدل شوی cDNA ترلاسه کړم ، زه به لومړی دا شاوخوا 3 ځله ضعیف کړم ، او بیا به د کور ساتونکي جین څخه د RT-PCR کولو لپاره کار واخلم ، د سایکلونو شمیر عموما 25 سایکلونه وي ترڅو مشخص غلظت وپیژني ، او بیا د وروستي کمولو فکتور وټاکي.
3 ایا تاسو ډاډه یاست چې ستاسو پرائمر کارول اسانه دي؟
دا کولی شي د qRT-PCR د خټکي وکر تیر کړي، مګر دا لاهم پیسې لګوي.د ډیرو پیسو پرته د لابراتوارونو لپاره، کله چې دوی ډیری پریمر ترلاسه کوي، دوی کولی شي د عادي RT-PCR څخه کار واخلي ترڅو وګوري چې دا یو واحد بانډ دی او د پرائمر ځانګړتیا وپیژني.که چیرې لابراتوار د پیسو کمښت نه وي، د ټولو پریمرونو ځانګړتیا یو ځل د خټکي منحني له لارې پیژندل کیدی شي.
4 ایا تاسو ډاډه یاست چې ستاسو تجربې شرایط مناسب دي؟
SYBR باید د قوي ر lightا څخه خوندي شي ، نو هڅه وکړئ د SYBR ریجنټ اضافه کولو پر مهال د سر څراغ بند کړئ ، او یوازې د بشپړولو لپاره تیاره ر lightا کارولو ته اړتیا لرئ.
SYBR په 4 درجو سانتي ګراد کې ذخیره کړئ.کله چې کارول کیږي، په نرمۍ سره پورته او ښکته پورته کړئ ترڅو ښه مخلوط شي ترڅو د فوم کولو څخه مخنیوی وشي، او په قوي توګه ورټیس مه کوئ.
ځینې ځوانې خویندې د نمونې د ګډولو له وېرې د PCR په تخته کې نښانونه جوړوي، چې دا ناسمه ده.ځکه چې ستاسو مارکرونه د فلوروسینټ سیګنالونو راټولولو باندې ډیر احتمال لري ، زه عموما ځوانو ته وړاندیز کوم چې په حافظه کې د مرستې لپاره تجربې نوټ بوکونه وکاروي ، لکه څنګه چې لاندې ښودل شوي.
شکل.د qRT-PCR نمونې بارولو ډیاګرام
5 ایا تاسو ډاډه یاست چې تاسو دا سم کوئ؟
ډاډه اوسئ چې دستکشې واغوندي، دستکشې واغوندي، دستکشې واغوندي او مهم شیان درې ځله ووایی.
د دې لپاره چې د SYBR روښانتیا کمه شي، زه په شخصي توګه غواړم لومړی یوه نمونه اضافه کړم، لکه څنګه چې لاندې انځور کې ښودل شوي.د تجربې له مخې، د یوې کوچنۍ نمونې اضافه کول احتمال لري چې د نمونې تېروتنې لامل شي.له همدې امله، د دې لپاره چې د لږ مقدار ټیمپلیټ اضافه کولو له امله رامینځته شوې خطا کمه شي، زه معمولا نمونه دوه چنده کوم، او د نمونې اضافه کولو په وخت کې د H2O2 اضافه کولو مقدار کمولو لپاره مقدار دوه چنده کوم.
شکل.د QRT-PCR بار کولو سکیمیک ډیاګرام
بیا د QRT-PCR سیسټم په لاندې ډول تنظیم کړئ.
شکل.د QRT-PCR سیسټم چمتو کولو ډیاګرام
یادونه: د ترتیب کولو پروسه باید په یخ کې ترسره شي.
د نمونې اضافه کولو وروسته، د شفاف سیل کولو فلم پیسټ کړئ.هڅه وکړئ د خپلو لاسونو سره د شفاف سیل کولو فلم سطح ته لاس مه ورکوئ، یوازې د فلم په دواړو خواوو کې د ځای څخه کار وکړئ.ځکه چې د ګوتو نښې ممکن د فلوروسینټ سیګنالونو راټولولو باندې هم اغیزه وکړي.بیا د سینټرفیوج څخه کار واخلئ ترڅو په چټکۍ سره د 10 s لپاره په ټیټ سرعت کې سینټرفیوج کړئ ترڅو نمونه په دیوال کې ځړول کیدو مخه ونیسي.
اړوند توليدات:
د پوسټ وخت: اپریل-28-2023
