د پریمر ډیزاین اساس (99٪ ستونزې حل کیدی شي)
1. پرائمر اوږدوالی: درسي کتاب 15-30bp ته اړتیا لري، معمولا شاوخوا 20bp.اصلي حالت د 18-24bp لپاره غوره دی ترڅو مشخصیت ډاډمن کړي، مګر څومره چې اوږد وي، ډیر اوږد پریمر به ځانګړتیا کمه کړي، او حاصلات کم کړي.
2. د پرائمر امپلیفیکیشن موده: 200-500bp مناسب دی، او ټوټه د ځانګړو شرایطو لاندې 10kb ته پراخه کیدی شي.
3. پرائمر بیس: د G+C محتوا باید 40-60٪ وي، د G+C امپلیفیکیشن اغیز ډیر لږ دی، ډیر G+C د غیر مشخص بډونو څرګندیدل اسانه دي.ATGC په تصادفي ډول په غوره توګه توزیع کیږي، د 5 څخه د زیاتو purine یا pyrimidine nucleotides د کلسترونو څخه مخنیوی کوي.د ثبات زیاتولو لپاره د 5′ پای او منځنیو ترتیبونو لپاره ملټي-gc، په 3′ پای کې د بډایه GC څخه ډډه وکړئ، د وروستیو 3 اډو لپاره هیڅ GC، یا د وروستیو 5 اډو څخه د 3 لپاره هیڅ GC نشته.
4. په پرائمرونو کې د ثانوي جوړښت څخه ډډه وکړئ، او د دوو پرائمرونو ترمنځ د بشپړولو څخه ډډه وکړئ، په ځانګړې توګه د 3 په پای کې بشپړول، که نه نو د پریمر ډیمر به جوړ شي او غیر مشخص امپلیفایډ بانډونه به تولید شي.
5. د پرائمر په 3 پای کې اډې، په ځانګړې توګه وروستي او پای پایې اډې، باید په کلکه سره جوړه شي ترڅو د نه جوړ شوي ترمینل اډې له امله د PCR ناکامۍ مخه ونیسي.
6. پرائمرونه د مناسبو فاصلو سایټونو سره یا اضافه کیدی شي، او پراخ شوي هدف ترتیب باید په غوره توګه مناسب فاصله ځایونه ولري، کوم چې د cleavage تحلیل یا مالیکولر کلونینګ لپاره خورا ګټور دی.
7. د پرائمر ځانګړتیا: پرائمر باید د نیوکلیک اسید ترتیب ډیټابیس کې د نورو ترتیبونو سره هیڅ څرګند هوموولوژي ونه لري.
8. د سافټویر کارول زده کړئ: PP5، Oligo6، DNAstar، Vector NTI، primer3 (دا آنلاین ډیزاین غوره کار کوي).
پورته منځپانګه کولی شي لږترلږه د پریمر ډیزاین ستونزې 99٪ حل کړي.
د پریمر ډیزاین توضیحات کنټرول کړئ
1. پرائمر اوږدوالی
د عمومي پریمر اوږدوالی 18 ~ 30 اډې دی.په عموم کې، د پریمر د انیل کولو تودوخې ټاکلو ترټولو مهم فاکتور د پریمر اوږدوالی دی.د پریمر د انیل کولو تودوخې عموما غوره کیږي (د Tm ارزښت -5 ℃)، او ځینې یې په مستقیم ډول د Tm ارزښت کاروي.لاندې فورمولونه د پریمرونو د انیل کولو تودوخې اندازه محاسبه کولو لپاره کارول کیدی شي.
کله چې د پریمر اوږدوالی له 20bp څخه کم وي: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
کله چې د پریمر اوږدوالی له 20bp څخه ډیر وي: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/اوږدوالی-5℃
سربیره پردې ، ډیری سافټویرونه د انیل کولو تودوخې محاسبه کولو لپاره هم کارول کیدی شي ، د محاسبې اصول به توپیر ولري ، نو ځینې وختونه محاسبه شوي ارزښت ممکن یو کوچنی تشه ولري.د PCR تعاملاتو اصلاح کولو لپاره، لنډ پرائمرونه چې د انیل کولو تودوخې د 54 ℃ څخه کم نه وي د غوره موثریت او ځانګړتیا لپاره کارول کیږي.
په ټولیز ډول، د پرائمر ځانګړتیا د هر اضافي نیوکلیوټایډ لپاره د څلورو فکتورونو لخوا زیاتیږي، نو د ډیری غوښتنلیکونو لپاره د پریمر لږترلږه اوږدوالی 18 نیوکلیوټایډ دی.د پرائمر اوږدوالی پورتنۍ حد خورا مهم ندی، په عمده توګه د غبرګون موثریت پورې اړه لري.د انټروپي له امله، پرائمر څومره چې اوږد وي، په هماغه اندازه چې دا د هدف DNA سره تړل کیږي ټیټ وي ترڅو د DNA پولیمیریز د تړلو لپاره یو مستحکم دوه اړخیزه نمونه جوړه کړي.
کله چې د پریمرونو ډیزاین کولو لپاره سافټویر وکاروئ، د پریمر اوږدوالی د TM ارزښت په بدل کې ټاکل کیدی شي، په ځانګړې توګه د فلوروسینس کمیتي PCR پرائمرونو لپاره، TM = 60℃ یا داسې نور باید کنټرول شي.
2.GC منځپانګه
عموما، د پریمر په ترتیب کې د G+C مینځپانګه 40٪ ~ 60٪ ده، او د GC مینځپانګه او د یو جوړه پریمرونو Tm ارزښت باید همغږي وي.که چیرې پریمر جدي GC یا AT تمایل ولري، د پریمر په 5 پای کې د A، T یا G او C tail مناسب مقدار اضافه کیدی شي.
3. د annealing حرارت
د annealing تودوخه باید 5 ℃ د unchain تودوخې څخه ټیټه وي.که چیرې د پریمر اډو شمیر لږ وي ، د انیل کولو تودوخې په مناسب ډول لوړ کیدی شي ، کوم چې کولی شي د PCR ځانګړتیا زیاته کړي.که چیرې د اډو شمیر لوی وي ، د انیل کولو تودوخې په مناسب ډول کم کیدی شي.د 4 ℃ ~ 6 ℃ د یوې جوړې پریمرونو ترمینځ د انیل کولو تودوخې توپیر به د PCR حاصل باندې اغیزه ونکړي ، مګر په مثالي توګه د یوې جوړه پریمرونو انیل کولو تودوخې یو شان دی ، کوم چې د 55 ℃ ~ 75 ℃ ترمینځ توپیر کولی شي.
4. د امپلیفیکیشن ټیمپلیټ د ثانوي جوړښت ساحې څخه ډډه وکړئ
دا غوره ده چې د ټیمپلیټ د ثانوي جوړښت سیمې څخه مخنیوی وشي کله چې پراخه شوې ټوټه غوره کړئ.د هدف ټوټې مستحکم ثانوي جوړښت د اړونده کمپیوټر سافټویر لخوا وړاندوینه او اټکل کیدی شي، کوم چې د ټیمپلیټ انتخاب لپاره ګټور دی.تجربې پایلې ښیي چې پراخول اکثرا ناکامه وي کله چې د پراخېدونکي سیمې وړیا انرژي (△G) له 58.6lkJ/mol څخه کم وي.
5. د هدف DNA سره سمون نه خوري
کله چې پراخ شوي هدف DNA ترتیب لوی وي، یو پریمر ممکن د هدف DNA ډیری برخو سره وصل شي، چې په پایله کې ډیری بډونه ښکاري.دا ځل دا اړینه ده چې د BLAST سافټویر ازموینې وکاروئ، ویب پاڼه:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.دوه سلسلې ترتیب کړئ (bl2seq).
زون 1 ته د پرائمر ترتیبونو ځړول او زون 2 ته د DNA سلسلې په نښه کول د تبادلې وړ دي ، او BLAST تکمیلي ، انټي سینس او نور امکانات محاسبه کوي ، نو کارونکي اړتیا نلري چې پام وکړي چې ایا دواړه زنځیرونه د احساس زنځیرونه دي.تاسو کولی شئ د GI شمیره هم دننه کړئ که تاسو په ډیټابیس کې د ترتیب GI شمیره پیژنئ ، نو تاسو اړتیا نلرئ د ترتیب لویه برخه پیسټ کړئ.په نهایت کې، په 3 کې په الائن کلیک وکړئ ترڅو وګورئ چې ایا پریمر په نښه شوي DNA کې ډیری هومولوګس سایټونه لري.
6. پرائمر ترمینل
د پرائمر 3 پای هغه ځای دی چیرې چې تمدید پیل کیږي، نو دا مهمه ده چې د پیل کولو څخه د نابرابرۍ مخنیوی وشي.د 3 پای باید د 3 پرله پسې G یا C څخه زیات نه وي، ځکه چې دا به د دې لامل شي چې پریمر په غلطۍ سره د G+C د بډای کولو ترتیب سیمه کې پیل شي.3 پای نشي کولی کوم ثانوي جوړښت رامینځته کړي، پرته له دې چې د ځانګړي PCR (AS-PCR) عکس العملونو کې، د پرائمر 3′ پای بې توپیره کیدی شي.د مثال په توګه، که چیرې د کوډون ساحه پراخه شي، د پریمر 3 پای باید د کوډون په دریم ځای کې پای ته ونه رسیږي، ځکه چې د کوډون دریم ځای د تخریب احتمال لري، کوم چې به د امپلیفیکیشن ځانګړتیا او موثریت اغیزمن کړي.کله چې ضمیمه پریمر وکاروئ، د کوډون کارولو میز ته مراجعه وکړئ، بیولوژیکي غوره توب ته پام وکړئ، د 3′ پای کې د ضمیمه پریمرونو څخه کار مه اخلئ، او د پریمرونو لوړ غلظت (1uM-3uM) وکاروئ.
7. د پرائمر ثانوي جوړښت
پرائمرونه پخپله باید تکمیلي سلسله ونه لري، که نه نو پریمرونه به پخپله د ویښتو په جوړښتونو کې ودریږي، او دا ثانوي جوړښت به د سټیریک خنډ له امله د پریمرونو او ټیمپلیټونو په پابندۍ اغیزه وکړي.که مصنوعي قضاوت وکارول شي، د پریمرونو دوامداره بشپړونکي اډې پخپله باید د 3bp څخه ډیر نه وي.د دوه پرائمرونو تر مینځ باید هیڅ ډول تکمیلات شتون ونلري، په ځانګړې توګه د 3 پای بشپړونکي اوورلیپ باید د پریمر ډیمرونو د جوړولو څخه مخنیوی وشي.په عموم کې، د پریمرونو د یوې جوړې تر مینځ باید د 4 پرله پسې اډو هومولوژي یا تکمیل نه وي.
8. مارکر یا لوکی اضافه کړئ
5 پای د امپلیفیکیشن ځانګړتیا باندې لږ تاثیر لري او له همدې امله د امپلیفیکیشن ځانګړتیا اغیزه کولو پرته ترمیم کیدی شي.د پریمر 5 پای کې ترمیم شامل دي: د انزایم بندیز سایټ اضافه کول؛لیبل شوی بایوټین، فلوروسینس، ډیګوکسین، Eu3+، او داسې نور. د پروټین پابند DNA ترتیبونه معرفي کړئ؛د میوټیشن سایټونو معرفي کول، د بدلون د سلسلې داخلول او ورکول او د پروموټر ترتیبونو معرفي کول، او داسې نور. اضافي اډې به لږ یا لږ د امپلیفیکیشن موثریت اغیزمن کړي او د پریمر ډیمر رامینځته کیدو چانس ډیروي، مګر د راتلونکي ګام لپاره باید ځینې امتیازات وشي.اضافي سلسلې چې د هدف په ترتیب کې شتون نلري، لکه د محدودیت سایټونه او د پروموټر ترتیبونه، پرته له دې چې ځانګړتیا اغیزه وکړي د پریمر 5′ پای ته اضافه کیدی شي.دا ترتیبونه د پریمر Tm ارزښتونو په محاسبه کې ندي شامل شوي، مګر باید د بشپړولو او داخلي ثانوي جوړښت لپاره ازموینه وشي.
9. Subclones
ډیری وخت، PCR یوازې ابتدايي کلونینګ دی، او بیا موږ اړتیا لرو چې د هدف ټوټه په مختلفو ویکٹرونو کې سبکلون کړو، نو موږ اړتیا لرو چې د PCR مرحله کې د راتلونکي عملیاتو لپاره اضافي اډې ډیزاین کړو.
د فرعي کلون کولو لپاره ډیزاین شوي ځینې ترتیبونه لاندې لنډیز شوي دي.
د بندیز endonuclease بندیز سایټ اضافه شوی
د انزایم محدودیت سایټونو اضافه کول د PCR محصولاتو فرعي کلون کولو لپاره ترټولو عام کارول کیږي.په عمومي توګه، د cleavage سایټ شپږ اډې لري، سربیره پردې، د فاصلې سایټ د 5 پای پای ته اړتیا لري چې 2 ~ 3 محافظتي اډې اضافه کړي.په هرصورت، د مختلف انزایمونو لخوا اړین محافظتي اډې شمیر توپیر لري.د مثال په توګه، SalⅠ هیڅ محافظتي اډې ته اړتیا نلري، EcoRⅤ 1 محافظتي اډې ته اړتیا لري، نه 2 محافظتي اډې ته اړتیا لري، او Hind 3 3 محافظتي اډې ته اړتیا لري.
LIC دم زیاتوي
د LIC بشپړ نوم Ligation-Independent cloning دی، د کلونینګ یوه طریقه چې د نووګین لخوا په ځانګړې توګه د PET ویکتور برخې لپاره اختراع شوې.د PET کیریر د LIC میتود لخوا چمتو شوی غیر بشپړونکي 12-15 بیس واحد سټرینډ سټیکي پایونه لري، کوم چې د هدف داخلولو ټوټې کې ورته چپکونکي پایونه بشپړوي.د امپلیفیکیشن موخو لپاره، د داخل شوي ټوټې پریمر 5′ ترتیب باید د LIC ویکتور بشپړ کړي.د T4 DNA پولیمیریز 3′→5′ خارجي فعالیت کولی شي د لنډ وخت وروسته داخل شوي ټوټه باندې یو واحد سټینډ لرونکی پای رامینځته کړي.ځکه چې محصول یوازې د چمتو شوي داخل شوي ټوټې او ویکتور د متقابل انیل کولو څخه رامینځته کیدی شي ، دا میتود خورا ګړندی او موثر دی ، او دا د کلونینګ لارښود دی.
لارښود شوی TA کلون tail add
د TA کلونینګ ونه توانید چې ټوټه په ویکٹر کې په نښه کړي، نو وروسته انویټروجن یو ویکتور معرفي کړ چې کولی شي کلونینګ په نښه کړي، کوم چې په یوه پای کې څلور مهم بنسټ GTGGS لري.له همدې امله، د PCR پرائمرونو په ډیزاین کې، تکمیلي سلسلې باید د دې مطابق اضافه شي، ترڅو ټوټې "مستقیم" شي.
که تاسو په وخت کې لنډ یاست، تاسو کولی شئ مستقیم ترکیب هڅه وکړئ، جین د ویکتور سره یوځای کړئ، کوم چې موږ په میوزیک پوهانو کې د ET جین ترکیب بولو.
D. د فیوژن کلونینګ طریقه
هیڅ لیګس ته اړتیا نشته، اوږد غبرګون ته اړتیا نشته.تر هغه وخته پورې چې د خطي ویکتور په دواړو سرونو کې ترتیب د پرائمرونو په ډیزاین کې معرفي شي، بیا د PCR محصول او لینر شوی ویکتور د انفیوژن انزایم محلول کې چې BSA لري اضافه کیږي او د نیم ساعت لپاره د خونې په حرارت درجه کې کیښودل کیږي، بدلون ترسره کیدی شي.دا طریقه په ځانګړې توګه د لوی حجم تبادلې لپاره مناسبه ده.
10. پریمر یوځای کړئ
ځینې وختونه، د پریمر ډیزاین په اړه یوازې محدود ترتیب معلومات پیژندل کیږي.د مثال په توګه، که یوازې د امینو اسید ترتیب معلوم وي، د یوځای کولو پرائمر ډیزاین کیدی شي.د ادغام پرائمر د مختلف ترتیبونو ترکیب دی چې د ټولو مختلف اساس امکاناتو استازیتوب کوي چې یو واحد امینو اسید کوډ کوي.د ځانګړتیاوو د زیاتوالي لپاره، تاسو کولی شئ د کوډون کارولو جدول ته مراجعه وکړئ ترڅو د مختلف ارګانیزمونو د اساس کارولو غوره توبونو مطابق ضمیمه کمه کړي.Hypoxanthine د ټولو اډو سره یوځای کیدی شي ترڅو د پریمر د انیل کولو تودوخې کم کړي.د پریمر په 3′ پای کې ضمیمه شوي اډې مه کاروئ ځکه چې په 3′ پای کې د وروستي 3 اډو انیل کول په غلط ځای کې د PCR پیل کولو لپاره کافي دي.د پریمر لوړ غلظت (1μM څخه تر 3μM) کارول کیږي ځکه چې په ډیری ضمیمه مرکبونو کې پریمرونه د هدف ټیمپلیټ لپاره ځانګړي ندي.
د PCR خام موادکنټرول
1. د پرائمر مقدار
د هر پریمر غلظت 0.1 ~ 1umol یا 10 ~ 100pmol دی.دا غوره ده چې د ټیټ مقدار پریمر سره اړین پایله تولید کړئ.د پرائمر لوړ غلظت به د غیر مطابقت او غیر مشخص پراخوالي لامل شي ، او د پریمرونو ترمینځ د ډیمرونو رامینځته کیدو چانس ډیروي.
2. پرائمر غلظت
د پریمر غلظت په ځانګړتیا اغیزه کوي.د غوره پریمر غلظت عموما د 0.1 او 0.5μM ترمنځ وي.د لوړ پریمر غلظت د غیر مشخص محصولاتو د پراخیدو لامل کیږي.
3. د پریمر د تودوخې انیل کول
د پریمر لپاره بل مهم پیرامیټر د خټکي تودوخې (Tm) دی.دا د تودوخې درجه ده کله چې 50٪ پریمرونه او بشپړونکي ترتیبونه د دوه اړخیزه DNA مالیکولونو په توګه ښودل کیږي.Tm د PCR انیلینګ تودوخې تنظیم کولو لپاره اړین دی.په مثالي توګه، د انیل کولو تودوخه دومره ټیټه ده چې د هدف ترتیب سره د پریمرونو مؤثره انیل کولو ډاډ ترلاسه کړي، مګر دومره لوړ دی چې غیر مشخص بندیز کم کړي.د مناسب انیل کولو تودوخې له 55 ℃ څخه تر 70 ℃ پورې.د انیل کولو تودوخه عموما د پریمر د Tm څخه 5 ℃ ټیټ ټاکل کیږي.
د Tm تنظیم کولو لپاره ډیری فورمولونه شتون لري، کوم چې د کارول شوي فارمول او د پریمرونو ترتیب پورې اړه لري خورا توپیر لري.ځکه چې ډیری فورمولونه د اټکل شوي Tm ارزښت چمتو کوي، د ټولو انیل کولو تودوخې یوازې یو پیل ټکی دی.ځانګړتیا د ډیری عکس العملونو تحلیل کولو سره ښه کیدی شي چې په تدریجي ډول د انیل کولو تودوخې لوړوي.د اټکل شوي Tm-5 ℃ څخه ښکته پیل کړئ، او په تدریجي ډول د 2 ℃ په زیاتوالي کې د انیل کولو تودوخه لوړه کړئ.د انیل کولو لوړه تودوخه به د پریمر ډیمرونو او غیر مشخص محصولاتو جوړښت کم کړي.د غوره پایلو لپاره، دوه پرائمرونه باید نږدې Tm ارزښت ولري.که چیرې د پریمر جوړه د Tm توپیر له 5 ℃ څخه ډیر وي، پرائمر به په دوره کې د ټیټ انیل کولو تودوخې په کارولو سره د پام وړ غلط پیل وښيي.که چیرې دوه پرائمرونه Tm توپیر ولري، د انیل کولو تودوخه د ټیټ Tm څخه 5 ℃ ټیټ کړئ.په بدیل سره، د ځانګړتیاوو د زیاتولو لپاره، پنځه دورې لومړی د انیل کولو تودوخې کې ترسره کیدی شي چې د لوړ Tm لپاره ډیزاین شوي، وروسته پاتې دورې د انیل کولو تودوخې کې چې د ټیټ Tm لپاره ډیزاین شوي.دا اجازه ورکوي چې د منزل ټیمپلیټ یوه برخه کاپي په سختو شرایطو کې ترلاسه شي.
4. پرائمر پاکوالی او ثبات
د دودیز پریمر معیاري پاکوالی د ډیری PCR غوښتنلیکونو لپاره کافي دی.د پاکولو په واسطه د بینزویل او اسوبوتیلیل ګروپونو لرې کول خورا لږ دي او له همدې امله د PCR سره مداخله نه کوي.ځینې غوښتنلیکونه پاکولو ته اړتیا لري ترڅو د ترکیب په پروسه کې د غیر بشپړ اوږدوالي ترتیبونه لرې کړي.دا تخریب شوي ترتیبونه واقع کیږي ځکه چې د DNA ترکیب کیمیا موثریت 100٪ نه دی.دا یوه ګردي پروسه ده چې تکراري کیمیاوي تعاملات کاروي ځکه چې هره اساس د 3′ څخه تر 5′ پورې DNA جوړولو لپاره اضافه کیږي.تاسو کولی شئ په هر دور کې ناکام شئ.اوږده پرائمرونه، په ځانګړې توګه هغه چې له 50 اډې څخه لوی وي، د قطع شوي ترتیبونو لوی تناسب لري او ممکن پاکولو ته اړتیا ولري.
د پرائمر حاصلات د مصنوعي کیمیا او پاکولو میتود اغیزمنتوب لخوا اغیزمن کیږي.د بایوفرماسیوټیکل شرکتونه، لکه سایټولوژي او شینګونګ، ټول د oligonucleoside ټول تولید ډاډمن کولو لپاره لږترلږه OD واحد کاروي.دودیز پریمر د وچ پوډر په شکل کې لیږدول کیږي.دا غوره ده چې پریمرونه په TE کې له سره حل کړئ ترڅو وروستی غلظت 100μM وي.TE د deionized اوبو څخه غوره دی ځکه چې د اوبو pH اکثرا تیزابي وي او د oligonucleosides د هایدرولیسس لامل کیږي.
د پریمرونو ثبات د ذخیره کولو شرایطو پورې اړه لري.وچ پوډر او منحل شوي پریمر باید په -20 ℃ کې زیرمه شي.په TE کې منحل شوي پریمرونه د 10μM څخه ډیر غلظت کې په -20 ℃ کې د 6 میاشتو لپاره په ثابت ډول زیرمه کیدی شي ، مګر یوازې د خونې په تودوخې (15 ℃ څخه تر 30 ℃) کې د 1 اونۍ څخه لږ لپاره زیرمه کیدی شي.د وچ پوډر پریمر لږترلږه د 1 کال لپاره په -20 C او د خونې په تودوخې (15 C څخه تر 30 C) کې تر 2 میاشتو پورې زیرمه کیدی شي.
5. انزایمونه او د هغوی غلظت
په اوس وخت کې، د Taq DNA پولیمیریز کارول کیږي اساسا د جین انجنیري انزایم دی چې د کولیفورم باکتریا لخوا ترکیب شوی.د انزایم مقدار چې د PCR عادي عکس العمل کټالیز کولو لپاره اړین دی شاوخوا 2.5U دی (د 100ul ټول عکس العمل حجم ته اشاره کوي).که غلظت خورا لوړ وي، دا کولی شي د غیر مشخص پراخوالي لامل شي؛که چیرې غلظت خورا ټیټ وي ، نو د مصنوعي محصول مقدار به کم شي.
6. د dNTP کیفیت او غلظت
د dNTP کیفیت د PCR امپلیفیکیشن غلظت او موثریت سره نږدې تړاو لري.د dNTP پاؤډ دانه ده، او د هغې تغیرات خپل بیولوژیکي فعالیت له لاسه ورکوي که چیرې دا په ناسم ډول ذخیره شي.د dNTP محلول تیزابي دی، او باید په لوړ غلظت کې د 1M NaOH یا 1M Tris.HCL بفر محلول سره وکارول شي ترڅو خپل PH 7.0 ~ 7.5 ته تنظیم کړي، د فرعي بسته بندۍ کوچنۍ اندازه، په -20℃ کې منجمد ذخیره.ډیری کنګل کول به dNTP تخریب کړي.د PCR غبرګون کې، dNTP باید 50 ~ 200umol/L وي.په ځانګړې توګه، پاملرنه باید د څلورو DNTPS غلظت ته ورکړل شي باید مساوي وي (د مساوي تیو چمتو کول).که چیرې د هر یو غلظت له نورو څخه توپیر ولري (لوړ یا ټیټ) ، د بې اتفاقۍ لامل کیږي.ډیر ټیټ غلظت به د PCR محصولاتو حاصل کم کړي.dNTP کولی شي د Mg2+ سره یوځای شي او د وړیا Mg2+ غلظت کم کړي.
7. سانچه (د هدف جین) نیوکلیک اسید
د ټیمپلیټ نیوکلیک اسید مقدار او د پاکولو کچه د PCR د بریا یا ناکامۍ لپاره یو له کلیدي اړیکو څخه دی.د DNA د پاکولو دودیز میتودونه معمولا د نمونو هضم او تخریب لپاره SDS او پروټیز K کاروي.د SDS اصلي دندې عبارت دي له: د حجرو په غشا کې د لیپیدونو او پروټینونو منحل کول، په دې توګه د جھلی پروټینونو په حل کولو سره د حجرو غشا ویجاړوي، او په حجره کې اټومي پروټینونه جلا کوي، SDS کولی شي د پروټینونو سره یوځای شي او د پروټینو سره یوځای شي.پروټیز K کولی شي پروټینونه هایدرولیس او هضم کړي ، په ځانګړي توګه د DNA سره تړلي هسټونونه ، او بیا د پروټینونو او نورو حجرو اجزاو استخراج لپاره عضوي محلول فینول او کلوروفارم کاروي ، او د نیوکلیک اسید د مخنیوي لپاره ایتانول یا isopropyl الکول کاروي.استخراج شوي نیوکلیک اسید د PCR عکس العملونو لپاره د نمونې په توګه کارول کیدی شي.د عمومي کلینیکي کشف نمونو لپاره، یو چټک او ساده طریقه کارول کیدی شي د حجرو منحل کولو، لیسټیټ رنځجن، د کروموزوم څخه پروټینونه هضم او لرې کولو لپاره وړیا هدف جینونو ته، او په مستقیم ډول د PCR پراخولو لپاره کارول کیدی شي.د RNA ټیمپلیټ استخراج معمولا د guanidine isothiocyanate یا protease K میتود کاروي ترڅو RNase د RNA تخریب مخه ونیسي.
8.Mg2+ غلظت
Mg2+ د PCR امپلیفیکیشن ځانګړتیا او حاصل باندې د پام وړ اغیزه لري.د PCR په عمومي غبرګون کې، کله چې د مختلفو dNTP غلظت 200umol/L وي، د Mg2+ مناسب غلظت 1.5 ~ 2.0mmol/L وي.د Mg2+ غلظت ډیر لوړ دی، د عکس العمل ځانګړتیا کمیږي، غیر مشخص پراخوالی واقع کیږي، ډیر ټیټ غلظت به د Taq DNA پولیمیریز فعالیت کم کړي، په پایله کې د عکس العمل محصولات کم شي.
مګنیزیم آئنونه د PCR په ډیری اړخونو اغیزه کوي، لکه د DNA پولیمیریز فعالیت، چې په حاصلاتو اغیزه کوي؛بله بیلګه د پریمر اینیلینګ دی، کوم چې ځانګړتیا اغیزه کوي.dNTP او ټیمپلیټ د مګنیزیم آئن سره وصل دي ، د انزایم فعالیت لپاره د وړیا مګنیزیم آئن مقدار کموي.د مګنیزیم آئن غوره غلظت د مختلف پریمر جوړه او ټیمپلیټونو لپاره توپیر لري، مګر د 200μM dNTP سره د PCR پیل کولو یو عادي غلظت 1.5mM دی (یادونه: د ریښتیني وخت مقداري PCR لپاره، د فلوروسینټ پروب سره له 3 څخه تر 5mm میګنیشیم آئن محلول وکاروئ).د وړیا مګنیزیم ایونونو لوړ غلظت حاصلات زیاتوي، مګر غیر مشخص پراخوالی زیاتوي او وفاداري کموي.د غوره غلظت د ټاکلو لپاره، د مګنیزیم آئن ټایټریشنونه د 0.5mM په زیاتوالي کې له 1mM څخه تر 3mM پورې ترسره شوي.د مګنیزیم آئن اصلاح کولو باندې د انحصار کمولو لپاره ، د پلاټینیم ټیک DNA پولیمریز کارول کیدی شي.د پلاټینیم تاق DNA پولیمیریز د دې وړتیا لري چې د Taq DNA پولیمیریز په پرتله د میګنیشیم آئن غلظت پراخه لړۍ کې فعالیت وساتي او له همدې امله لږ اصلاح ته اړتیا لري.
9. د Pcr ترویج اضافه کونکي
د انیل کولو تودوخې اصلاح کول، د پریمر ډیزاین، او د مګنیزیم آئن غلظت د ډیری ټیمپلیټونو خورا مشخص لوړولو لپاره کافي دی؛په هرصورت، ځینې ټیمپلیټونه، په شمول د لوړ GC منځپانګې سره، اضافي اقداماتو ته اړتیا لري.اضافه کونکي چې د DNA د تودوخې تودوخې اغیزه کوي د محصول ځانګړتیا او حاصلاتو ښه کولو لپاره بله لاره چمتو کوي.د غوره پایلو لپاره د ټیمپلیټ بشپړ تخریب ته اړتیا ده.
برسېره پردې، ثانوي جوړښت د پریمر پابندۍ او د انزایم توسیع مخه نیسي.
د PCR اضافه کونکي ، پشمول د فارماایډ ، DMSO ، ګلیسیرین ، بیټین ، او PCRx انانسر حل ، امپریشن ته وده ورکوي.د دوی ممکنه میکانیزم د خټکي تودوخې کمول دي، په دې توګه د پریمرونو انیل کولو کې مرسته کوي او د ثانوي جوړښت سیمې له لارې د DNA پولیمیریز توسیع سره مرسته کوي.د PCRx حل نورې ګټې لري.لږترلږه میګنیشیم آئن اصلاح ته اړتیا ده کله چې د پلاټینیم تاق DNA پولیمیریز او پلاټینیم Pfx DNA پولیمیریز سره کارول کیږي.پدې توګه ، د پلاټینم تخنیک د اضافې سره یوځای شوی ترڅو ځانګړتیا زیاته کړي پداسې حال کې چې د دریمې طریقې انحصار کموي ، میګنیشیم آئن اصلاح کول.د غوره پایلو لپاره، د اضافه کولو غلظت باید مطلوب وي، په ځانګړې توګه DMSO، فارمامیډ، او ګلیسرول، چې د Taq DNA پولیمریز مخنیوی کوي.
10. ګرم پیل
هاټ سټارټ PCR د غوره پریمر ډیزاین سربیره د PCR ځانګړتیا ښه کولو لپاره یو له خورا مهم میتودونو څخه دی.که څه هم د Taq DNA پولیمیریز مطلوب اوږدوالی تودوخه 72 ℃ ده، پولیمیریز د خونې په حرارت کې فعال پاتې کیږي.پدې توګه ، غیر مشخص محصولات تولید کیږي کله چې د PCR عکس العمل چمتو کولو پرمهال او د تودوخې دورې په پیل کې د تودوخې درجه د انیل کولو تودوخې څخه ټیټه وي.یوځل چې جوړ شي ، دا غیر مشخص محصولات په مؤثره توګه پراخه کیږي.هاټ سټارټ PCR په ځانګړي ډول مؤثره دی کله چې د پریمر ډیزاین لپاره کارول شوي سایټونه د جینیاتي عناصرو موقعیت پورې محدود وي ، لکه د سایټ لارښود تغیرات ، د بیان کلونینګ ، یا د DNA انجینرۍ لپاره کارول شوي جنیټیک عناصرو جوړونه او لاسوهنه.
د Taq DNA پولیمیریز فعالیت محدودولو لپاره یو عام میتود په یخ باندې د PCR عکس العمل حل چمتو کول او د مخکې ګرم شوي PCR اپریټس کې ځای په ځای کول دي.دا طریقه ساده او ارزانه ده، مګر دا د انزایم فعالیت نه بشپړوي او له همدې امله د غیر مشخص محصولاتو زیاتوالی په بشپړه توګه له منځه نه وړي.
د تودوخې پریمینګ د DNA ترکیب ځنډوي ترڅو د لازمي برخې مخنیوی وکړي تر هغه چې د PCR اپریټس د تودوخې تودوخې ته ورسیږي.د لاسي تودوخې پیل کولو ډیری میتودونه، په شمول د Taq DNA پولیمیریز ځنډ اضافه کول، پیچلي دي، په ځانګړې توګه د لوړې کچې غوښتنلیکونو لپاره.د تودوخې لومړني میتودونه د موم ډال کاروي ترڅو اړین اجزا تړل شي، په شمول د مګنیزیم آئنونو یا انزایمونو، یا په فزیکي توګه د عکس العمل اجزا جلا کولو لپاره، لکه ټیمپلیټونه او بفرونه.د تودوخې دورې په جریان کې، مختلف اجزا خوشې کیږي او د موم د خړوبولو سره یوځای مخلوط کیږي.د لاسي ګرم پیل میتود په څیر، د موم شیلډ طریقه پیچلې او د ککړتیا خطر لري او د لوړ تولید غوښتنلیکونو لپاره مناسب ندي.
د پلاټینم DNA پولیمریز د اتوماتیک ګرم پیل PCR لپاره مناسب او موثر دی.د پلاټینم تاق DNA پولیمیریز د ټیک DNA پولیمیریز په مقابل کې د مونوکلونل انټي باډي سره یوځای د recombinant Taq DNA پولیمیریز څخه جوړ دی.انټي باډي د PCR لخوا جوړ شوي ترڅو د تودوخې اوږدې مودې کې د انزایم فعالیت مخه ونیسي.Taq DNA پولیمیریز د 94 ℃ د ډینیټوریشن مرحلې موصلیت په جریان کې په عکس العمل کې خوشې شو ، د بشپړ پولیمیریز فعالیت بحالوي.د حرارتي ابتکار لپاره د کیمیاوي پلوه تعدیل شوي Taq DNA پولیمیریز برعکس، پلاټینیم انزایم په 94℃ (10 څخه تر 15 دقیقو) کې د پولیمریز فعالولو لپاره اوږده موصلیت ته اړتیا نلري.د PlatinumTaq DNA پولیمریز سره، د Taq DNA پولیمیریز 90٪ فعالیت د 2 دقیقو وروسته په 94℃ کې بحال شو.
11. Nest-PCR
د نیسټ شوي پرائمرونو په کارولو سره د امپلیفیکیشن پرله پسې پړاوونه کولی شي ځانګړتیا او حساسیت ښه کړي.لومړی پړاو د 15 څخه تر 20 دورې معیاري لوړوالی دی.د لومړني امپلیفیکیشن محصول یوه کوچنۍ برخه له 100 څخه تر 1000 ځله کمه شوې او د 15 څخه تر 20 دورو لپاره د امپلیفیکیشن دوهم پړاو کې اضافه شوې.په بدیل توګه، لومړنی پراخ شوی محصول د جیل پاکولو په واسطه اندازه کیدی شي.د امپلیفیکیشن دوهم پړاو کې یو ځړول شوی پریمر کارول کیږي، کوم چې کولی شي د لومړي پریمر دننه د هدف ترتیب سره وصل شي.د nested PCR کارول د څو هدفونو سایټونو د پراخیدو احتمال کموي ځکه چې د دواړو سیټونو د پرائمرونو بشپړولو لپاره لږ هدف ترتیبونه شتون لري.د ورته پرائمرونو سره د سایکلونو ورته ټولټال شمیر (30 څخه تر 40) غیر مشخص سایټونه پراخ کړي.Nested PCR د محدود هدف ترتیبونو حساسیت زیاتوي (د بیلګې په توګه، نادر مرنا) او د ستونزمن PCRS ځانګړتیاو ته وده ورکوي (د بیلګې په توګه 5′ RACE).
12. د PCR ښکته کول
د PCR ښکته کول د PCR د لومړیو څو دورو لپاره د سخت انیل کولو شرایطو په کارولو سره ځانګړتیا ته وده ورکوي.دوره د اټکل شوي Tm څخه نږدې 5 ℃ لوړ د annealing تودوخې کې پیل کیږي، بیا هر دوره د 1 ℃ څخه تر 2 ℃ پورې راټیټه کیږي تر هغه چې د annealing تودوخې د Tm 5 ℃ څخه کم وي.یوازې د منزل ټیمپلیټ د لوړ هومولوژي سره به پراخه شي.دا محصولات په راتلونکو دورو کې پراختیا ته دوام ورکوي، پراخ شوي غیر مشخص محصولات راټولوي.د PCR ښکته کول د هغو میتودونو لپاره ګټور دي چیرې چې د پرائمر او هدف ټیمپلیټ ترمینځ د هومولوژي کچه معلومه نده، لکه د AFLP DNA د ګوتو نښې.
اړونده PCR کیټونه
د 2× PCR هیروTMد مکس سیسټم د عادي PCR مکس سیسټم په پرتله د PCR مخنیوی کونکو ته لوړ زغم لري ، او کولی شي په اسانۍ سره د مختلف پیچلي ټیمپلیټونو د PCR امپلیفیکیشن سره مقابله وکړي.د ځانګړي عکس العمل سیسټم او لوړ موثریت تاق هیرو د PCR عکس العمل د لوړ لوړولو موثریت ، ځانګړتیا او حساسیت رامینځته کوي.
د لوړ لوړولو موثریت
دا د 5'→ 3' DNA پولیمریز فعالیت او 5'→ 3' exonuclease فعالیت لري، پرته له 3'→ 5' exonuclease فعالیت.
د ریښتیني وخت PCR Easyᵀᴹ-SYBR شنه I کټ
ځانګړی - مطلوب بفر او د هاټ سټارټ ټیک انزایم کولی شي د غیر مشخص لوړیدو او پریمر ډیمر رامینځته کیدو مخه ونیسي
لوړ حساسیت - کولی شي د ټیمپلیټ ټیټ کاپي کشف کړي
کټ یو ځانګړی فورجین ریورس ټرانسکرپشن ریجنټ کاروي او د فورجین هوټ سټار ټیک DNA پولیمیریز د ځانګړي عکس العمل سیسټم سره یوځای د عکس العمل د لوړولو موثریت او ځانګړتیا ته په مؤثره توګه وده ورکوي.
د پوسټ وخت: می-09-2023
