د RT-qPCR تجربه کې د RNA استخراج او کیفیت ارزونه، د بیرته راګرځولو لیږد او qPCR درې مرحلې شاملې دي، هر ګام ډیر احتیاطي تدابیر لري، موږ به یې په لاندې تفصیل سره معرفي کړو.

Ⅰ.د RNA کیفیت ارزونه

د RT-qPCR تجربه کې، د RNA استخراج بشپړولو وروسته، د RNA کیفیت ارزولو ته اړتیا لري، او تعقیب تجربه یوازې د وړتیا وروسته ترسره کیدی شي.د ارزونې میتودونو کې شامل دي سپیکٹرو فوټومیټر، د Agilent gel electrophoresis، Agilent 2100 analysis، چې تر ټولو عام کارول شوي سپیکٹرو فوټومیټر او د اګاروز جیل الیکٹروفورسس میتود کشف کول دي.دا باید په یاد ولرئ چې دا دوه میتودونه باید د RNA غلظت ، پاکوالي او بشپړتیا کشف او تحلیل بشپړولو لپاره یوځای وکارول شي ترڅو د RNA کیفیت ډاډمن شي.

اړوند RNA جلا کولو کټ: 

د Cell Total RNA Isolation Kit

لوړ پاک شوی او د لوړ کیفیت ټول RNA په 11 دقیقو کې د مختلف کلتوري حجرو څخه ترلاسه کیدی شي.

د څارویو ټول RNA جلا کولو کټ

په چټکه او مؤثره توګه د مختلفو څارویو نسجونو څخه د لوړ پاکوالي او لوړ کیفیت ټول RNA استخراج کړئ.

سپیکٹرو فوټومیټر:

سپیکٹرو فوټومیټر په عمده توګه د RNA غلظت او پاکوالي معلومولو لپاره کارول کیږي ، مګر دا نشي کولی د RNA او جینومیک پاتې شونو بشپړتیا کشف کړي.د دوی په منځ کې، A260/280 او A260/230 د RNA د پاکوالي کشف کولو لپاره مهم پیرامیټرونه دي، او د RNA پاکوالی د دوی د ارزښتونو د بدلون له مخې کشف کیدی شي:

1. 1.9< A260/280< 2.1، دا په ګوته کوي چې د RNA پاکوالی ښه دی؛A260/280<1.9، دا په ګوته کوي چې ممکن په RNA کې د پروټین پاتې شي؛A260/280>2.1، د RNA احتمالي جزوي تخریب په ګوته کوي، کوم چې د اګرز جیل الیکٹروفورسیس لخوا نور تایید کیدی شي.

2. 2.0< A260/230< 2.2، دا په ګوته کوي چې د RNA پاکوالی ښه دی؛A260/230< 2.0، دا په ګوته کوي چې ممکن په RNA کې د عضوي اجزاو پاتې شونه وي، لکه فینول، ایتانول یا شکر.

د اګروز جیل الیکټروفوریسس:

د Agarose gel electrophoresis assay کولی شي د RNA بشپړتیا، جینوم او د پروټین پاتې شونو تحلیل کړي، مګر نشي کولی په سمه توګه د RNA غلظت اندازه کړي یا د عضوي ریجنټونو پاتې شونو کشف کړي.د مثال په توګه د یوکریوټیک RNA ټیمپلیټونه واخلئ:

1. RNA د agarose gel electrophoresis سره مخامخ شو.که چیرې د جیل نقشه کې د 28sRNA، 18sRNA او 5.8sRNA یوازې درې واحدونه شتون ولري، نو دا په ګوته کوي چې استخراج شوی RNA ثابت دی.که چیرې د ځړولو پدیده شتون ولري، دا د RNA جزوی تخریب په ګوته کوي.

2. که چیرې د ګلو سوراخ او 28sRNA بانډ ترمنځ یو واحد روښانه بانډ شتون ولري، ممکن د جینومیک DNA پاتې شي.

3. که د ګوتو په سوري کې بندونه ښکاره شي، دا په ګوته کوي چې ممکن د پروټین او نورو میکرو مالیکولر موادو پاتې شونه وي.

Ⅱ. برعکس نقل

وروسته له دې چې د RNA استخراج بشپړ شو، دا باید د راتلونکو تجربو لپاره په cDNA کې بدل شي، نو د بیرته راګرځولو ګام اړین دی.ریورس ټرانسکرپشن به د ریورس ټرانسکریټیس او پریمر انتخاب څخه معرفي شي:

د ټرانسکریپټیس انتخاب برعکس:

په عام ډول ریورس ټرانسکریپټیسس کې AMV RTase او MMLV RTase شامل دي.د AMV RTase RNase H قوي فعالیت لري، د لنډ ترکیب اوږدوالی، د کم ترکیب اندازه او ښه حرارتي ثبات (42 ~ 55℃).د MMLV RTase RNase H فعالیت کمزوری دی، د ترکیب اوږدوالی اوږد دی، د ترکیب اندازه لوړه ده، او د حرارتی ثبات کمزوری دی (37 ~ 42℃).

ځکه چې د RNase H انزایم د RNA ټیمپلیټ د تخریب کولو فعالیت لري، MMLV د کمزوري RNase H فعالیت سره باید د ریورس لیږد په وخت کې غوره شي، او وروسته د جنیټیک انجینرۍ وروسته، د MMLV حرارتي ثبات کیفیتي لیپ ته رسیدلی.د فارجین اخیستلForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV د ریورس لیږد لپاره) د مثال په توګه، دا یو نوی ریورس ټرانسکریپټیس دی چې په E. coli انجنیر شوي باکتریا کې د جینیاتي بیا جوړونې ټیکنالوژۍ په کارولو سره څرګند شوی.دا یو بیا یوځای کیدونکی DNA پولیمیریز دی چې د واحد سټنډ شوي RNA، DNA، یا RNA: DNA هایبرډ څخه د بشپړونکي DNA سټنډ ترکیب کوي.دا د RNase H فعالیت نلري، قوي ثبات، قوي RNA تړاو، او لوړ کشف حساسیت.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV د ریورس لیږد لپاره)

د پریمر انتخاب:

عموما د RT پرائمرونه په دریو کټګوریو کې راځي: oligo dT، تصادفي پرائمرونه، او د جین ځانګړي پرائمرونه.د مختلف تجربوي اړتیاو سره سم د کارولو لپاره مناسب پریمر غوره کړئ.

1. که چیرې نمونه د یوکریوټیک اصل څخه وي او ناوخته cDNA د معمول PCR امپلیفیکیشن لپاره کارول کیږي، Oligo (dT) توصیه کیږي؛که وروسته تجربه یوازې د qPCR لپاره کارول کیږي، Oligo (dT) سپارښتنه کیږي چې د تصادفي پریمرونو سره مخلوط شي ترڅو د ریورس لیږد موثریت ښه کړي.

2. که چیری ټیمپلیټ د پروکاریوټس څخه وي، random primers یا د جین ځانګړي پریمرونه باید د ریورس لیږد لپاره غوره شي.

Ⅲ.qPCR

د فلوروسینس اندازه کول په عمده ډول د کمیتي میتودونو انتخاب ، د پریمر ډیزاین اصول ، د ROX انتخاب ، د عکس العمل سیسټم ترتیب او د عکس العمل شرایطو تنظیم کولو څخه توضیح کیږي.

د کمیتي میتودونو انتخاب:

کمیتي میتودونه په نسبي کمیتي میتودونو او مطلق کمیتي میتودونو ویشل شوي دي.نسبي مقدار کول د جین بیان باندې د درملنې ځینې میتودونو اغیزې موندلو لپاره کارول کیدی شي ، په مختلف وختونو کې د جین بیان توپیر کشف کړي او په مختلف نسجونو کې د جین بیان توپیر پرتله کړي.مطلق مقدار کول کولی شي په ویروس کې د نیوکلیک اسید مقدار کشف کړي او داسې نور.کله چې تجربې ترسره کوو، موږ باید د خپلو تجربو مطابق مناسب کمیتي میتودونه غوره کړو.

د پریمر ډیزاین اصول:

د qPCR لپاره د پریمر ډیزاین مستقیم د امپلیفیکیشن موثریت او د محصول ځانګړتیا سره تړاو لري.له همدې امله، په سمه توګه د ښه پرائمر ډیزاین کول د بریالي qPCR لومړی ګام دی.د پریمر ډیزاین کې، لاندې اصولو ته باید پاملرنه وشي کله چې د دودیز پریمر ډیزاین اصول پوره کیږي:

1. د هدف ټوټې اوږدوالی د 100 او 300 bp ترمنځ کنټرول کیږي؛

2. د کراس-ایکسون ډیزاین ترڅو د جینومیک DNA نفوذ مخه ونیسي؛

3. ډیزاین شوي پرائمرونه باید د لوړولو موثریت لپاره ازموینه وشي، او یوازې کله چې د پراخولو موثریت معیاري (90-110٪) ته ورسیږي کیدای شي د کمیتي تجربو لپاره وکارول شي؛

4. د پرائمر غلظت معمولا د 0.1uM او 1.0uM ترمنځ غوره کیږي.

د انتخابROX:

د کمیتي عکس العمل په پروسه کې، ROX کولی شي د نظری لارې توپیر، د پایپټینګ تېروتنه یا د حجم توپیر په مساوي ډول د تبخیر او کنډیشن له امله رامینځته کړي، د پایلو تکرار وړتیا ښه کړي.په هرصورت، دا باید په پام کې ونیول شي چې د ROX انتخاب په وسیله پورې اړه لري.که چیرې د qPCR وسیله په اتوماتيک ډول د سوراخونو ترمینځ توپیر سم کړي ، نو دا د ROX اضافه کولو ته اړتیا نلري؛که نه نو، دا د ROX سمون اضافه کولو ته اړتیا لري.د ریجنټونو په اخیستلو کې کوچني شریکان باید د هغه وسیلې مطابق وي چې د سم ROX غوره کولو لپاره کارول کیږي، وروسته له تېروتنو څخه ډډه وکړئ.

د غبرګون سیسټم چمتو کول:

د 20ul او 50ul عکس العمل حجم غوره کیږي.د سیسټم د جوړولو په وخت کې باید لاندې ټکو ته پاملرنه وشي:

1. د عکس العمل سیسټم باید په الټرا کلین ورک بینچ کې د هوا له لارې چمتو شي، نوي ddH₂O د هرې تجربې لپاره کارول کیږي؛

2. هره تجربه د NTC چمتو کولو ته اړتیا لري ترڅو تصدیق کړي چې ایا په سیسټم کې ککړتیا شتون لري، او د پرائمرونو هر جوړه باید د سیسټم چمتو کولو په وخت کې NTC ترسره کړي؛

3. د دې لپاره چې معلومه کړي چې آیا په RNA کې د gDNA پاتې شونه شتون لري، NRT د هرې نمونې لپاره د کشف لپاره چمتو کیدی شي؛

4. کله چې د سیسټم چمتو کول، سپارښتنه کیږي چې لږترلږه 3 تخنیکي تکرارونه د یوې نمونې لپاره ترسره کړئ؛

5. کله چې نمونه cDNA وي، نو سپارښتنه کیږي چې 5-10 ځله ضعیف کړئ ترڅو د qPCR تجربې کې د ریورس لیږد سیسټم مخنیوی اغیز کم کړي.دا غوره ده چې د ټیمپلیټ مقدار د تدریجي له مخې وپلټئ، ترڅو د CT ارزښت د 20-30 ترمنځ راشي؛

6. د عکس العملونو اړین شمیر معلوم کړئ، د عکس العملونو د شمیر په اساس 5-10٪ زیاتوالی، او د حجم ترتیب شمیره محاسبه کړئ؛

7، سیسټم د پریمکس اصولو په کارولو سره چمتو شوی، د سینټرفیوګریشن وروسته مخلوط او ډاډ ترلاسه کوي چې هیڅ بلبل نشته؛

8، تر هغه ځایه چې امکان ولري د ملاتړ وړ مصرف کونکي غوره کړئ.

اړوند RT-qPCR کټ