د کشف ځانګړتیا
په ډیری قضیو کې، د پریمر ډیزاین موخه د PCR ځانګړتیا اعظمي کول دي.دا د ډیری متغیرونو د ډیر یا لږ وړاندوینې وړ نفوذ لخوا ټاکل کیږي.یو مهم متغیر د پریمر په 3 پای کې ترتیب دی.
په مهمه توګه، د PCR ارزونه د ځانګړتیا لپاره ډیزاین شوي په پراخه متحرک سلسله کې د لوړ موثریت ساتلو احتمال لري، ځکه چې ارزونه د غیر مشخص پراخولو محصولات نه تولیدوي، په دې توګه د PCR ریجنټونو سره سیالي کوي یا د اصلي امپلیفیکیشن غبرګون مخه نیسي.
البته، په ځینو حاالتو کې، ځانګړتیا خورا مهمه نه ده، د بیلګې په توګه، کله چې هدف د نږدې اړونده مګر مختلف ناروغیو اندازه کول وي، ځانګړي ډیزاین، اصلاح او تصدیق معیارونو ته اړتیا وي.
د خټکي وکر د امپلیکون ځانګړتیا ارزولو لپاره یو معیاري میتود دی، لږترلږه په دې شرط چې ایا یو واحد هدف پراخ کړي.په هرصورت، دا باید ټینګار وشي چې د خټکي منحنی خطونه ګمراه کیدی شي ځکه چې، د بیلګې په توګه، دوی د suboptimal primers او د ټیټ ټیمپلیټ غلظت د ګډو اغیزو لخوا اغیزمن کیدی شي.
P5 |د خټکي وکر د Tm بدلونونه ښیې چې د دوه هدف DNAs د مختلف مقدارونو دوه کشفونو څخه ترلاسه شوي.
الف. په لوړ غلظت (ad) کې، د qPCR اندازه کولو بشپړیدو وروسته هیڅ څرګند پریمر ډیمر شتون نلري.لکه څنګه چې د ټیمپلیټ غلظت 50 کاپي (e) ته راټیټیږي، یو غیر مشخص محصول څرګندیدل پیل کوي او په ټیټ غلظت (f) کې یوازینی محصول بدلیږي.
B. ازموینې په ټولو هدفونو غلظت کې ورته Tms ثبت کړل، او حتی په ټیټ غلظت (5 کاپي) کې هیڅ څرګند پریمر ډیمر شتون نلري.کله چې د دې دوه کشف میتودونو کارول، په NTCs کې د پراخولو محصولات ندي موندل شوي.
P5 د تحلیل منحني منحني ښیي چې د نمونو سره ترلاسه شوي په کوم کې چې ټیمپلیټ په مختلف غلظت کې شتون لري.P 5a ښیي چې په دوه ټیټ غلظت کې د تولید شوي غیر مشخص امپلیفیکیشن محصولاتو Tms د ځانګړي امپلیکونونو په پرتله ټیټ دي.
په ښکاره ډول، دا د کشف کولو طریقه نشي کولی په معتبره توګه د هغو هدفونو کشف کولو لپاره وکارول شي چې په ټیټ غلظت کې شتون لري.
په زړه پورې خبره دا ده چې NTCs، د بیلګې په توګه، نمونې چې هیڅ ډول DNA نلري، د (غیر مشخص) امپلیفیکیشن محصولات ندي ثبت کړي، دا په ګوته کوي چې د پس منظر جینومیک DNA کولی شي په غیر مشخص تعدیل/پولیمیریزیشن کې برخه واخلي.
ځینې وختونه دا ډول شالید پرائمرونه او غیر مشخص امپلیفیکیشن درملنه نشي کیدی ، مګر دا اکثرا ممکنه وي چې د کشف میتود ډیزاین کړئ چې په هیڅ ډول کېنډۍ غلظت او NTC (P 5b) کې غیر مشخص امپلیفیکیشن نلري.
دلته، حتی د Cq 35 سره د هدف غلظت پراخوالی ثبت کول به یو ځانګړی تحلیل وکر تولید کړي.په ورته ډول، NTCs د غیر مشخص زیاتوالي نښې نښانې ندي ښودلي.ځینې وختونه، د کشف چلند ممکن د مور په مایع پورې تړاو ولري، او یوازې غیر مشخص پراخوالی په ځانګړو بفر ترکیبونو کې کشف کیږي، کوم چې ممکن د مختلف Mg2+ غلظت پورې اړه ولري.
د کشف ثبات
د Ta اصلاح کول د qPCR کشف کولو تجربوي تصدیق او اصلاح کولو پروسې کې یو ګټور ګام دی.دا د تودوخې (یا د تودوخې رینج) په ښودلو سره د پریمر سیټ قوي کیدو مستقیم اشاره وړاندې کوي کوم چې د NTC پراخه کولو پرته ترټولو ټیټ Cq تولیدوي.
په حساسیت کې د دوه څخه تر څلور چنده توپیر ممکن د هغو خلکو لپاره مهم نه وي چې د لوړ mRNA څرګندونه لري، مګر د تشخیصي ازموینو لپاره، دا ممکن د مثبت او غلط منفي پایلو ترمنځ توپیر معنی ولري.
د qPCR پرائمر د Ta ملکیتونه ممکن خورا توپیر ولري.ځینې ازموینې خورا پیاوړې ندي، او که دوی د پریمرونو د مطلوب Ta ارزښت لاندې ترسره نشي، دوی به په چټکۍ سره سقوط وکړي.
دا مهمه ده ځکه چې دا ډول کشف اکثرا په ریښتینې نړۍ کې ستونزمن وي، او د نمونې پاکوالی، د DNA غلظت، یا د نورو DNA شتون ممکن غوره نه وي.
برسېره پردې، د هدف کاپي شمیره ممکن په پراخه کچه توپیر ولري، او ریجنټ، پلاستيکي لوښي، یا وسایل ممکن د ازموینې ترتیب کولو په وخت کې کارول شوي څخه توپیر ولري.
P6|د تودوخې درجه د PCR کشف کولو مختلف قويتوب ښیې.
الف. د Bioline Sensifast SYBR ماسټر مکس (د کتلاګ شمیره BIO-98050) څخه کار واخلئ ترڅو د انسان دماغ RNA څخه جوړ شوي cDNA باندې PCR ترسره کړي.
ب. د Bio-Rad د CFX qPCR وسیله وکاروئ ترڅو د اپلین د پراخولو نقشه او تحلیل وکر ثبت کړئ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGTGGTGATCTCCTAGG).
C. د ACSBG1 امپلیفیکیشن ګراف او د خټکي وکر (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. د GFAP امپلیفیکیشن ګراف او تحلیل وکر (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs په مختلف انیل کولو تودوخې کې ثبت شوي، د Cq کې توپیر ښیې چې د 7C د تودوخې درجې لاندې ثبت شوي.
P 6 د ناغوښتل شوي ازموینې یوه عادي پایله ښیې ، چیرې چې qPCR د 59C او 67C (P 6a) ترمینځ د تدریجي Tas په کارولو سره ترسره شوی ، د انسان د مغز ځانګړي جینونو لپاره پرائمر کاروي.
دا د امپلیفیکیشن ګراف څخه لیدل کیدی شي چې د Opalin پرائمرونه له مثالي څخه لرې دي ځکه چې د دوی غوره Ta رینج خورا تنګ دی (شکل 6b)، دا دی، Cqs په پراخه کچه ویشل شوي، په پایله کې Cqs د دوی د غوره Cqs په پرتله د پام وړ ټیټ دي.
دا کشف طریقه بې ثباته ده او کیدای شي د suboptimal amplification لامل شي.له همدې امله، د پریمرونو دا جوړه باید له سره ډیزاین شي.برسېره پردې، د خټکي منحني تحلیل (انسیټ) ښیي چې د دې کشف میتود ځانګړتیا هم ممکن ستونزمن وي، ځکه چې د هر Ta د خټکي منحل توپیر لري.
د ACSBG1 کشف میتود چې په P 6c کې ښودل شوی د پورته اوپلین کشف میتود په پرتله خورا قوي دی ، مګر دا لاهم له مثالي څخه لرې دی ، او احتمال شتون لري چې دا ښه شي.
په هرصورت، موږ ټینګار کوو چې د پیاوړتیا او ځانګړتیاو ترمنځ هیڅ اړین اړیکه شتون نلري، ځکه چې د دې کشف میتود لخوا تولید شوي تحلیل منحني په ټولو ټاس (انسیټ) کې ورته لوړ ارزښت ښیي.
له بلې خوا، د پیاوړتیا ازموینه خورا زغمونکې ده، د Tas په پراخه لړۍ کې ورته Cqs تولیدوي، لکه څنګه چې د GFAP ازموینه کې په P 6d کې ښودل شوي.
د Cqs توپیر چې په ورته 8 درجې سانتي ګراد کې ترلاسه شوي له 1 څخه کم دی، او د تحلیل منحني (انسیټ) د تودوخې په دې حد کې د کشف ځانګړتیاوې تاییدوي.د یادولو وړ ده چې محاسبه شوي Tas او اصلي Ta رینج ممکن ډیر توپیر ولري.
ډیری لارښوونې شتون لري چې د څیړونکو سره د اغیزمن پریمرونو ډیزاین کولو کې مرسته وکړي، چې ډیری یې د اوږدې مودې مقرراتو پراساس دي او د پریمر 3 پای ته ډیره پاملرنه شوې.ډیری وختونه سپارښتنه کیږي چې د 3 په پای کې G یا C او دوه G یا C اډې (GC کلیمپ) شامل کړئ، مګر د وروستیو 5 اډو څخه دوه څخه زیات نه وي.
په عمل کې، دا قواعد کولی شي څیړونکو ته لارښوونه وکړي، مګر دا اړینه نه ده چې په ټولو شرایطو کې سم وي.
P7 |د پریمر 3 پای په ځانګړتیا یا موثریت لږ تاثیر لري.
الف. د انسان د HIF-1α (NM_181054.2) جین لپاره د پریمرونو موقعیت.
B. د شپږ ازمایښت توکو د پراخولو لپاره د Agilent Brilliant III SYBR شنه مور شراب (Cat. No. 600882) وکاروئ.
C. د امپلیفیکیشن ګراف او د خټکي وکر د Bio-Rad د CFX qPCR وسیلې او 3′ پای پریمر لخوا ثبت شوی.NTCs په سور کې ښودل شوي.
د هرې ازموینې توکي د Cqs ریکارډ
د مثال په توګه، په P 7 کې پایله د 3 پای قاعدې سره مخالفت کوي.ټول ډیزاین اساسا ورته پایلې تولیدوي، یوازې د دوه پرائمر ترکیبونو سره چې په NTC کې غیر مشخص پراخوالي لامل کیږي.
په هرصورت، موږ نشو کولی د GC کلپ اغیزې ملاتړ وکړو، ځکه چې پدې حالت کې، د A یا T کارول د اعظمي 30 اډو په توګه ځانګړتیا نه کموي.
ټیسټ C، چیرته چې F پریمر په GGCC کې پای ته رسیږي، په NTCs کې Cqs ثبت کړي، دا په ګوته کوي چې یو څوک غواړي د 30 په پای کې د دې ترتیبونو څخه ډډه وکړي.موږ ټینګار کوو چې د پریمر جوړه غوره 3′ پای ترتیب ټاکلو یوازینۍ لار دا ده چې د ځینې نوماند پریمرونه په تجربوي ډول ارزونه وشي.
د لوړولو موثریت
په مهمه توګه، که څه هم د غیر مشخص PCR کشف هیڅکله مشخص نشي کیدی، د امپلیفیکیشن موثریت د انزایم، مور مایع، اضافه کولو، او د سایکل چلولو شرایطو په بدلولو سره په ډیری بیلابیلو لارو تنظیم او اعظمي کیدی شي.
د PCR کشف کولو موثریت ارزولو لپاره، دا غوره ده چې د هدف نیوکلیک اسید څخه 10 یا 5 ځله سیریل ډیلیشن وکاروئ ، دا د "معیاري منحني میتود" دی.
که د PCR امپلیکون یا مصنوعي DNA هدفونه د معیاري منحني تولید لپاره کارول کیږي، د دې هدفونو سیریل ډیلیشنونه باید د پس منظر DNA (لکه جینومیک DNA) سره مخلوط شي.
P۸ |د PCR موثریت ارزولو لپاره د کمولو وکر.
الف. د HIF-1 لپاره پرائمرونه وکاروئ: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA او R: TGTCCTGTGTGGTGACTTGTCC او Agilent's Brilliant III SYBR شنه ماسټر مکس (د کتالوګ شمیره 600882) د PCR او خټکي منحني شرایطو لپاره.
B. 100 ng RNA د 1 ng د انسان جینومیک DNA ته 5 ځله د 100 ng RNA برعکس نقل شوی ، 2 ځله ضعیف شوی ، او په سیریل ډول د cDNA نمونې 5 ځله ضعیف شوي.د خټکی وکر په انسیټ کې ښودل شوی.
C. د دوهم cDNA نمونې لپاره د RT عکس العمل، کمول، او سیریل کمول تکرار شوي، او پایلې ورته وې.
P 8 دوه معیاري منحني ښیي چې په دوه مختلف cDNA نمونو کې د ورته کشف میتود په کارولو سره ، پایله یې ورته موثریت دی ، شاوخوا 100٪ ، او د R2 ارزښت هم ورته دی ، دا د تجربې ډیټا او ریګریشن لاین یا ډیټا د لینریت درجې ترمینځ د فټ درجه.
دوه معیاري منحني د پرتلې وړ دي، مګر دقیقا ورته ندي.که هدف په سمه توګه د هدف اندازه کول وي، دا باید په پام کې ونیول شي چې دا د منلو وړ نه ده چې د کاپي شمیرې محاسبه چمتو کړئ پرته له دې چې ناڅرګندتیا تشریح کړي.
P۹ |د اندازه کولو ناڅرګندتیا د معیاري وکر په کارولو سره د مقدار کولو سره تړاو لري.
الف. د GAPDH (NM_002046) لپاره د PCR او خټکي منحني شرایطو د ترسره کولو لپاره پریمر وکاروئ.F: ACAGTTGCCATGTAGACC او R: TAACTGGTTGAGCACAGG او بایولین سینسفیسټ SYBR ماسټر مکس (د لیست شمیره BIO-98050).
B. د امپلیفیکیشن چارټ، د خټکي منحني او معیاري وکر د Bio-Rad CFX qPCR وسیلې سره ثبت شوی.
C. معیاري منحنی ګراف او 95٪ د اعتماد وقفه (CI).
D. د کاپي شمیره او د درې Cq ارزښتونو 95٪ باور وقفه د ډیلیشن منحني څخه اخیستل شوي.
P 9 ښیي چې د غوره شوي ازموینې لپاره، د یو واحد معیاري وکر اصلي تغیر تقریبا 2 ځله دی (95٪ د باور وقفه، لږترلږه تر اعظمي پورې)، کوم چې ممکن ترټولو کوچنی بدلون وي چې تمه کیدی شي.
اړوند محصول:
د پوسټ وخت: سپتمبر-30-2021
