1. د RNA محلول جذب معلوم کړئ
په 280، 320، 230، او 260 nm کې جذب په ترتیب سره د نیوکلیک اسید ارزښتونه، شالید (حل turbidity)، د مالګې غلظت، او عضوي مواد لکه پروټین، په ترتیب سره څرګندوي.عموما یوازې OD260/OD280 (تناسب، R) وګورئ.کله چې 1.8 ~ 2.0 وي، موږ فکر کوو چې په RNA کې د پروټین یا نورو عضوي موادو ککړتیا برداشت کیدی شي، مګر دا باید په پام کې ونیول شي چې کله Tris د جذب کشف کولو لپاره د بفر په توګه کارول کیږي، د R ارزښت ممکن د 2 څخه ډیر وي (عموما دا باید <2.2 وي).کله چې R <1.8 وي، په محلول کې د پروټین یا نورو عضوي موادو ککړتیا خورا روښانه وي، او د RNA برخلیک د اړتیاو سره سم ټاکل کیدی شي.کله چې R> 2.2، دا پدې مانا ده چې RNA په یو واحد نیوکلیک اسید کې هایډرولیز شوی.
2. د RNA الکتروفورټیک نمونه
په عموم کې، د RNA الکتروفورسس لپاره د ډینټورینګ جیل کارول کیږي، مګر که دا یوازې د RNA کیفیت معلومولو لپاره وي، د ډینټورینګ جیل اړین نه دی، او عادي اګروز جیل کارول کیدی شي.د الکتروفورسیس موخه د 28S او 18S بانډونو بشپړتیا او د دوی تناسب، یا د mRNA سمیر بشپړتیا کشف کول دي.عموما، که د 28S او 18S بانډونه روښانه، روښانه او تیز وي (د بندونو څنډو ته اشاره کول روښانه دي)، او د 28S روښانتیا د 18S بانډ څخه دوه چنده زیاته ده، موږ د RNA کیفیت ښه ګڼو.
پورتنۍ هغه دوه میتودونه دي چې موږ یې په عام ډول کاروو، مګر د دې دوو میتودونو څخه هیڅ یو موږ ته په روښانه توګه نه شي ویلای چې آیا د RNA محلول کې پاتې RNase شتون لري.که چیرې په محلول کې د RNase خورا لږ مقدار شتون ولري، نو دا زموږ لپاره ستونزمنه ده چې د پورتنۍ طریقې سره یې کشف کړو، مګر ډیری ورپسې انزیماتیک تعاملات د 37 درجو څخه پورته او د اوږدې مودې لپاره ترسره کیږي.په دې توګه، که د RNA محلول کې د RNase خورا لږ مقدار شتون ولري، نو په راتلونکو تجربو کې به د دوی رول لوبولو لپاره خورا مناسب چاپیریال او وخت وي، او البته دا وخت به تجربه سړه وي.لاندې موږ یو میتود معرفي کوو چې کولی شي تصدیق کړي چې ایا د RNA محلول کې پاتې RNase شتون لري.
3. د تودوخې د ساتنې ازموینه
د نمونې غلظت له مخې، د RNA محلول څخه دوه 1000 ng RNA راوباسئ او په 0.5 ملی لیتر سینټرفیوج ټیوب کې یې اضافه کړئ، او د pH 7.0 Tris بفر سره یې د 10 ul ټول حجم ته ضمیمه کړئ، او بیا د ټیوب کیپ مهر کړئ.یو یې د تودوخې په دوامداره اوبو حمام کې په 70 درجې سانتي ګراد کې واچوئ او د 1 ساعت لپاره یې ګرم وساتئ.بله برخه په یخچال کې -20 درجې د 1 ساعت لپاره زیرمه شوې.کله چې وخت پای ته ورسیږي، دوه نمونې د الکتروفوریسس لپاره لرې کړئ.وروسته له دې چې الکتروفورسیس بشپړ شي، د دواړو الکتروفوریټیک بانډونه پرتله کړئ.که د دواړو بانډونه یوشان وي یا کوم مهم توپیر ونه لري (البته د دوی بانډونه هم په 2 میتود کې شرایط پوره کوي)، دا پدې مانا ده چې د RNA محلول کې د RNase ککړتیا شتون نلري، او د RNA کیفیت خورا ښه دی.برعکس، که چیرې نمونه په 70 درجې سانتي ګراد کې ښکاره تخریب ښیي، دا په ګوته کوي چې د RNA محلول کې د RNase ککړتیا شتون لري.
2 د RNA استخراج لپاره تجربې میتودونه او تخنیکونه
هغه ستونزې چې موږ ډیری وختونه د RNA استخراج په وخت کې ورسره مخ کیږو دا دي: (1) د RNA حاصل کم دی؛(2) RNA د مالګې جدي ککړتیا لري.(3) RNA جدي عضوي محلول ککړتیا لري؛(4) د نمونې تخریب او نورې ستونزې
1. په عام ډول د ټول RNA استخراج ریجنټونه کارول کیږي
د guanidine isothiocyanate میتود او Trizol میتود د څارویو نسجونو او حیواني حجرو څخه د ټول RNA استخراج لپاره ترټولو عام کارول شوي میتودونه دي.دا په ځانګړې توګه د کوچنیو نمونو او نسجونو لپاره مناسبه ده چې استخراج یې په ځانګړې توګه ستونزمن وي، لکه د خرگوش د پوستکي او د څارویو د نښلونکي نسج څخه د ټول RNA استخراج؛سربیره پردې، Trizol، د عمومي هدف lysis reagent په توګه، د نبات د نسجونو، باکتریا، فنګسي او نورو نسجونو استخراج لپاره هم کارول کیدی شي.د نبات نسجونو لپاره چې پولیساکرایډونه او پولیفینول لري، لکه کیمیلیا اولیفیرا، د چای پاڼې، ریپسیډ او نور، د CTAB طریقه هم د RNA د راټولولو لپاره کارول کیدی شي.
د دودیز میتود په توګه، د ډبل کالم طریقه د عادي تودوخې عملیات له امله هم خورا مشهوره ده، د RNase اضافه کولو ته اړتیا نشته، او خوندیتوب - د استخراج لپاره کلوروفارم، فینول او نور عضوي ریجنټونه نشته.((وړاندیز شوي محصولات )
2. د حیواناتو د نسجونو څخه د ټول RNA استخراج
(1) هڅه وکړئ چې تازه نسج غوره کړئ، که دا تازه نه وي (په غوره توګه په دریو میاشتو کې - 80 ℃ په یخچال کې یا په مایع نایټروجن کې کنګل شوي. کله چې نسج پرې کړئ، مستقیم د خونې په حرارت کې مه پرې کوئ، ډاډ ترلاسه کړئ چې په یخ بکس کې یې واچوئ، هڅه وکړئ چې د بار بار یخولو او یخولو څخه مخنیوی وکړئ.
(2) د نسج کوچنۍ ټوټې پرې کولو لپاره پاکې کینچۍ او ټیزر وکاروئ، هڅه وکړئ د نسج مرکزي برخه د نمونې د پرې کولو پر مهال پرې کړئ، یا لومړی د نسج لویه ټوټه له مینځ څخه پرې کړئ، او بیا نمونه د تازه چیرا موقعیت کې پرې کړئ.له منځه وړل شوي نسج باید په بشپړه توګه ټوټه شي، ټوټه شوې نسج د RNase پرته په EP ټیوب کې واچوي، lysate اضافه کړي، ټوټه شوې نسج باید په بشپړه توګه د lysate سره ښکاره شي، او د یووالي لپاره چمتو شي.
(3) د نورمال نسجونو لپاره، د مونګ لوبیا په اندازه نسجونه (30-60 mg) د همغږي کولو لپاره غوره کړئ.که په نسجونو کې په زیاته اندازه پروتین، غوړ، یا کثافه فایبر لرونکي نسجونه لکه ځيګر ولري، په مناسبه توګه د پرې شوي نسج اندازه زیاته یا کمه کړئ (اختیاري) 10-20 mg غوره کړئ).
(4) که چیرې د کب عضلات، د زینګ غوښه، جیلیفش او نور نسجونه چې د اوبو لوړ مواد لري استخراج شي، د نمونې حجم باید په مناسب ډول زیات شي (100-200 mg وړاندیز شوی).
(5) که شرایط اجازه ورکړي، د څارویو نسج په مستقیم ډول د یو لوړ پاسه نسج هوموجنیزر سره یو ځای کیدو وروسته استخراج کیدی شي، که داسې وسایل شتون نلري.
(6) د وروستي استخراج څخه وروسته ترلاسه شوي RNA باید سمدلاسه په یخ بکس کې کیښودل شي ترڅو د RNA تخریب کم شي.
3. د څارویو حجرو RNA استخراج
(1) د تعلیق حجرې: په مستقیم ډول سینټرفیوژ کړئ او منځنی یې پریږدئ، د 1-2 ځله لپاره د جراثیمي PBS سره مینځل، بیا د PBS مناسب مقدار سره تعلیق کړئ، او بیا د لیسس لپاره لیسیټ اضافه کړئ.د مایع په بشپړه توګه له مینځه وړلو وروسته په مستقیم ډول د اوریدلو حجرو ته لیسټیټ مه اضافه کړئ.دا به د هیسټون کڅوړه د دې لامل شي چې د لیز شوي حجرو په بهرنۍ طبقه کې وروسته له هغې خوشې شي چې د پریپیټ شوي حجرو بهر ته ودریږي ، په دې توګه د لیسیټ سره د ګولی دننه حجرو اړیکه محدودوي.په پایله کې د حجرو نیمګړتیا او د RNA حاصل کمیږي.
(2) هغه حجرې چې نیمه تړلي وي یا په کلکه سره نه وي: د مینځلو له مینځه وړلو وروسته ، د PBS سره 1-2 ځله ومینځئ ، بیا په مستقیم ډول د PBS مناسب مقدار جذب کړئ او د کلتور کڅوړه په پایپټ یا ټوپک سره ووهئ ترڅو حجرې له مینځه ویسي ، او RNA وړیا حجرو ته یې لیږدوي.د استخراج لپاره د انزایم EP ټیوب ته lysate اضافه کړئ.
(3) Adherent Cells: باید لومړی د ټریپسین سره هضم شي، بیا د RNase-free EP ټیوبونو کې راټول شي، د سپرناټینټ لرې کولو لپاره سینټرفیوګ شوي، د اضافي ټریپسین لرې کولو لپاره د PBS سره 1-2 ځله مینځل شوي، او د PBS مناسب مقدار سره بیا ځای پرځای شوي بیا د استخراج مرحلې ته ځي.
4. د نبات RNA استخراج
د نبات نسجونه په فینولیک مرکباتو کې بډایه دي، یا په پولیساکرایډونو کې بډای دي، یا ځینې ناپیژندل شوي ثانوي میټابولیتونه لري، یا د RNase لوړ فعالیت لري.دا مواد د حجرو له لیسز وروسته په کلکه د RNA سره یوځای کیږي ترڅو د حل کېدونکي کمپلیکس یا کولایډیل پریپیټیټس رامینځته کړي ، کوم چې لرې کول ستونزمن دي.نو ځکه، کله چې موږ د نبات نسج استخراج کوو، موږ اړتیا لرو چې د نباتاتو لپاره کټ غوره کړو.په کټ کې لیسټیټ کولی شي په مؤثره توګه د پولیفینولونو اسانه اکسیډریشن او د پولیساکرایډ مرکباتو او نیوکلیک اسیدونو جلا کولو ستونزې حل کړي.
(د پولیساکرایډ پولیفینول نبات RNA استخراج لپاره، وړاندیز شوي محصولات:
(1) د نبات پوستکي، دانه، تخمونه، پاڼې او نور باید په بشپړه توګه په هاوان کې مینځل شي.د پیسولو پروسې په جریان کې، مایع نایتروجن باید په وخت سره ډک شي ترڅو د نمونې د خولو څخه مخنیوی وشي.د ځمکې نمونه باید ژر تر ژره په lysate کې اضافه شي او د RNA تخریب څخه مخنیوی وشي.
(2) د فایبر بډایه نمونو لپاره لکه د وریجو او غنمو پاڼو لپاره، د استخراج اندازه باید په مناسبه توګه کمه شي، که نه نو د نسج پیسیدل او لیسز به بشپړ نشي، په پایله کې د استخراج شوي RNA کم حاصل ورکوي.
(3) د نبات نسجونو لپاره چې د اوبو ډیر مقدار لري لکه د انارو میوه، د هندواڼې میوه، د شفتالو میوه او نور، د نمونې اندازه باید په مناسبه توګه لوړه شي (100-200 mg اختیاري دي).
(4) د نبات نسجونه، لکه د نبات پاڼي، ریزوم، سخت میوه او نور مواد عموما سپارښتنه کیږي چې مایع نایتروجن وکاروي ترڅو په هاوان کې اجزا په ښه توګه هاوان کړي، او بیا د استخراج مرحلې ته لاړ شي.د نسجونو دودیز همغږي کونکي ممکن د نبات د نسجونو همغږي کولو کې اغیزمن نه وي، او عموما سپارښتنه نه کیږي.
5. د RNA استخراج لپاره احتیاطي تدابیر
(1) د نسجونو نمونې باید د امکان تر حده تازه وي ترڅو د بار بار یخولو او پړسیدو مخنیوی وشي.
(2) نسج باید د استخراج په وخت کې په بشپړه توګه په ځمکه کې وي، او د نسج اندازه باید ډیره کمه نه وي، یوازې ډیر پریږدئ.
(3) د lysate اضافه کولو وروسته باید کافي انکیوبیشن وخت ورکړل شي ترڅو نمونه په بشپړ ډول لیز شي.
(4) کله چې د استخراج لپاره د Trizol طریقه کاروئ، د سټراټیفیکیشن وروسته د سپرناټینټ جذبولو اصول "ترجیح ورکول کیږي چې لږ تنفس کړئ د ډیر تنفس کولو په پرتله"، او باید منځنۍ طبقې ته ونه استخراج شي، که نه نو دا به د جدي جینومیک DNA ککړتیا سبب شي.
(5) کله چې مینځل کیږي ، د مینځلو مایع باید په بشپړ ډول د ټیوب دیوال شاوخوا ته ننوځي ترڅو په بشپړ ډول مینځل یقیني شي.
(6) د کالم استخراج میتود لپاره، د مینځلو وروسته د کالم د جلا کولو سربیره، د جذب کالم هم باید په الټرا پاک بنچ کې واچول شي او د 5-10 دقیقو لپاره وچ شي ترڅو عضوي محلول په بشپړه توګه تبخیر شي ترڅو وچ شي.
(7) د کالم میتود په وروستي اخراج کې، د DEPC اوبه اضافه کولو وروسته، دا باید د 3-5 دقیقو لپاره وخورئ، یا د DEPC اوبه باید مخکې له مخکې 60 درجې سانتي ګراد ته تودوخه شي، ترڅو د الیشن حاصل زیات شي.په دودیز Trizol cleavage او isopropanol precipitation میتود کې، وروستی RNA د DEPC په اوبو کې منحل کیږي، نو د تحلیل لپاره باید مناسب وخت ورکړل شي، او د سینټریفیوج ټیوب لاندې باید په دوامداره توګه د پایپټ ټپ سره مینځل شي.
3 ټد ټیټ RNA غلظت / ضعیف کیفیت لاملونه او حلونه
1. حاصلات ډیر ټیټ دي
استخراج شوی نمونه ډیره ټیټه ده، ټوله اندازه ناکافي ده، یا استخراج شوې نمونه ډیره ده او لیسز بشپړ شوی نه دی؛د مناسب کیفیت نسج یا حجرې باید د استخراج لپاره وکارول شي، د نمونې دمخه درملنه باید په ښه توګه ترسره شي، او لیسز باید کافي وي.
2. د جینوم پاتې شونه
کله چې د Trizol میتود په واسطه استخراج کیږي، کله چې سپرناټینټ د پرت کولو وروسته منځنۍ طبقه ته وخوړل شي، د جدي جینوم ککړتیا سبب کیږي؛اضافي پاملرنه باید وشي کله چې پرت کېښودل شي ترڅو په مینځنۍ طبقه کې د چوسیدو مخه ونیول شي.که د کالم میتود د استخراج لپاره کارول کیږي، یو کټ چې DNase I لري د استخراج لپاره غوره کیدی شي.په غشا کې جذب شوي نیوکلیک اسید په مستقیم ډول د DNase I سره هضم کیږي، کوم چې کولی شي د DNA پاتې شونه کم کړي.
3. د RNA تخریب
دا کیدای شي پخپله د استخراج شوي نمونې تخریب وي، یا د استخراج پروسې په جریان کې رامنځته شوي تخریب؛تر هغه ځایه چې ممکنه وي، تازه نمونې باید د RNA استخراج لپاره وکارول شي، او راټول شوي نمونې باید په وخت سره د مایع نایتروجن یا -80 ° C په یخچال کې زیرمه شي، او د بار بار یخولو او پړسوب څخه باید مخنیوی وشي.RNase/DNase وړیا لارښوونې، سینټرفیوج ټیوبونه او نور توکي باید د RNA استخراج په پروسه کې وکارول شي.د استخراج پروسه باید د امکان تر حده چټکه وي.استخراج شوی RNA باید په یخ بکس کې کیښودل شي او په وخت کې -80 کې زیرمه شي.که استخراج شوی RNA د جیل الیکٹروفورسس لخوا کشف کولو ته اړتیا ولري، الیکٹروفورسس باید د استخراج وروسته سمدلاسه ترسره شي، او د الیکٹروفورسس بفر باید د نوي چمتو شوي سره بدل شي.
4. مالګه او د عضوي محلول پاتې شونو
د استخراج ریجنټونه د فینول او ګوانډین مالګې لري، او د مینځلو محلول ایتانول لري.د استخراج پروسې په جریان کې، لیسټیټ په بشپړه توګه جذب او رد شوی نه و، او د مینځلو محلول په بشپړه توګه وچ شوی نه و.پاتې شوي مالګې او عضوي محلولونه د بیا تکرار لیږد او PCR لپاره زیانمن دي.د مخنیوي مختلف درجې ، نو د استخراج پروسې په جریان کې د نسج لیسیټ باید په بشپړ ډول لرې شي ، او مینځل باید کافي وي ترڅو د ټیوب شاوخوا دیوالونه مینځل شي.سربیره پردې ، ټیوب خالي شوی او مینځل یو اړین ګام دی ، کوم چې به د عضوي موادو پاتې شونه نور هم کم کړي.
د RNA استخراج په اړه د نورو معلوماتو لپاره، مهرباني وکړئ زموږ ویب پاڼه تعقیب کړئ:
د نورو معلوماتو لپاره www.foreivd.com.
د پوسټ وخت: دسمبر-01-2022
