دا ښه معلومه ده چې په مرکزي عقیده کې، RNA د DNA او پروټین بیان ترمنځ د لیږد منځګړیتوب دی.د DNA کشف سره پرتله کول، د RNA کشف کولی شي په ژوندی موجوداتو کې د جین بیان په ډیر معقول ډول منعکس کړي.هغه تجربې چې RNA پکې شاملې دي عبارت دي له: qRT-PCR، RNA-Seq، او د فیوژن جین کشف، او داسې نور. د RNA د ځانګړتیاوو پراساس (د RNA د شکر حلقه د DNA د شکر حلقې په پرتله یو ډیر وړیا هایدروکسیل ګروپ لري)، په چاپیریال کې د RNases لوی شمیر سره یوځای، RNA ډیر بې ثباته او د DNA په پرتله خورا اسانه دی.کثافات دننه کول، کثافات بهر کول، که چیرې د RNA کیفیت ښه نه وي، نو د تجربې پایلې باید د قناعت وړ نه وي، په ځانګړې توګه د ناسم معلوماتو یا ضعیف تکرار وړتیا په توګه څرګند شوي.له همدې امله، د RNA پروسس ته باید ډیره پاملرنه وشي، او د کیفیت کنټرول لینک هم خورا مهم دی ترڅو د راتلونکو تجربوي معلوماتو دقت او دقت ډاډمن شي.

د RNA د کیفیت کنټرول لپاره، په عمومي توګه لاندې عام استعمال شوي میتودونه شتون لري:

• سپیکٹرو فوټومیتري
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• د ریښتیني وخت فلوروسینټ کمیتي PCR
• د کیوبیټ فلوروسینټ رنګ کولو طریقه

01 سپیکٹرو فوټومیتري

RNA دوه ګونی بانډونه لري او د 260nm موج اوږدوالی کې د جذب لوړوالی لري.د Lambert-Beer د قانون له مخې، موږ کولی شو د RNA غلظت په 260nm کې د جذب چوکۍ څخه محاسبه کړو.برسېره پردې، موږ کولی شو د RNA خالصیت د 260nm، 280nm او 230nm د جذب چوټیو تناسب سره محاسبه کړو.280nm او 230nm په ترتیب سره د پروټینونو او کوچنیو مالیکولونو د جذب چوکۍ دي.د وړ RNA پاکوالي د A260/A280 او A260/A230 تناسب باید له 2 څخه ډیر وي. که دا د 2 څخه کم وي، دا پدې مانا ده چې د RNA نمونه کې پروټین یا کوچني مالیکول ککړتیا شتون لري او بیا پاکولو ته اړتیا لري.د ککړتیا سرچینې به د لاندې جریان تجربو اغیزه وکړي، لکه د PCR تعاملاتو د لوړولو موثریت مخنیوی، د ناسم کمیتي پایلو پایله.د RNA پاکوالی په راتلونکو پایلو باندې لوی تاثیر لري، نو سپیکٹرو فوټومیټري عموما د نیوکلیک اسید تجربو کې په لومړي ګام کې د کیفیت کنټرول لازمي اړیکه ده.

شکل 1. عادي RNA/DNA د جذب سپیکٹرم

02 Agarose gel electrophoresis

د پاکوالي سربیره، د RNA بشپړتیا هم د RNA کیفیت قضاوت کولو لپاره یو مهم شاخص دی.د RNA تخریب به په نمونه کې د لوی شمیر لنډو ټوټو لامل شي، نو د RNA ټوټې چې په مؤثره توګه کشف کیدی شي او د حوالې ترتیب لخوا پوښل کیدی شي کم شي.د RNA بشپړتیا په 1٪ agarose جیل کې د ټول RNA الیکٹروفورسس لخوا معاینه کیدی شي.دا طریقه کولی شي جیل پخپله تنظیم کړي، یا د بشپړتیا ازموینې لپاره د مخکې جوړ شوي E-Gel™ سیسټم څخه کار واخلي.د ټولو RNA 80٪ څخه ډیر د ریبوسومال RNA دی، چې ډیری برخه یې د 28S او 18S rRNA (د تی لرونکو سیسټمونو کې) څخه جوړه شوې ده.د ښه کیفیت RNA به دوه روښانه روښانه بارونه وښیې، کوم چې په ترتیب سره 28S او 18S روښانه بارونه دي، په ترتیب سره په 5 Kb او 2 Kb کې، او نسبت به د 2: 1 سره نږدې وي.که چیرې دا په توزیع حالت کې وي، دا پدې مانا ده چې د RNA نمونه کیدای شي تخریب شوي وي، او دا سپارښتنه کیږي چې د RNA کیفیت نور ازموینې لپاره وروسته تشریح شوي میتود وکاروئ.

شکل 2. په اګرز جیل الیکٹروفورسیس کې د خراب شوي (لین 2) او پاتې RNA (لین 3) پرتله کول

03 Agilent Bioanalyzer

د اګرز جیل الیکٹروفورسیس میتود سربیره چې پورته تشریح شوي، کوم چې موږ سره د RNA بشپړتیا په ساده او چټکتیا پیژندلو کې مرسته کولی شو، موږ کولی شو د RNA بشپړتیا معلومولو لپاره د Agilent bioanalyzer څخه هم کار واخلو.دا د RNA غلظت او بشپړتیا ارزولو لپاره د مایکرو فلوډیکس ، کیپلیري الیکٹروفورسیس ، او فلوروسینس ترکیب کاروي.د RNA نمونې پروفایل تحلیل کولو لپاره د جوړ شوي الګوریتم په کارولو سره، Agilent bioanalyzer کولی شي د حوالې RNA بشپړتیا ارزښت محاسبه کړي، د RNA بشپړتیا شمیره (له دې وروسته د RIN په نوم یادیږي) [1].هرڅومره چې د RIN ارزښت لوی وي ، د RNA بشپړتیا لوړه وي (1 خورا تخریب شوی ، 10 خورا بشپړ دی).ځینې ​​تجربې چې RNA پکې شامل دي د کیفیت ارزونې لپاره د پیرامیټر په توګه د RIN کارولو وړاندیز کوي.د لوړې کچې ترتیب کولو تجربو اخیستل (له دې وروسته د NGS په نوم یادیږي) د مثال په توګه ، د Oncomine ™ Human Immune Repertoire لارښوونې چې د ترمو فشر د آنکومین پینل لړۍ کې د B حجرو او T حجرو انټيجن ریسیپټرو کشف کولو لپاره کارول کیږي ، وړاندیز کوي چې د RIN ارزښتونو سره نمونې د 4 څخه ډیر اغیزمن لوستل کیدی شي (4،3 او 3 څخه ډیر اغیزمن وي.د مختلف پینلونو لپاره مختلف وړاندیز شوي سلسلې شتون لري، او ډیری وختونه لوړ RIN کولی شي ډیر اغیزمن معلومات راوړي.

شکل 3، د Oncomine™ د انسان معافیت ریپرټویر تجربو کې، د 4 څخه ډیر RIN سره نمونې کولی شي ډیر اغیزمن لوستل او د T حجرو کلون کشف کړي.【2】

په هرصورت، د RIN ارزښت هم ځینې محدودیتونه لري.که څه هم RIN د NGS تجربوي معلوماتو کیفیت سره لوړ اړیکه لري، دا د FFPE نمونو لپاره مناسبه نه ده.د FFPE نمونې د اوږدې مودې لپاره په کیمیاوي ډول درملنه شوي، او استخراج شوي RNA عموما نسبتا ټیټ RIN ارزښت لري.په هرصورت، دا پدې معنی ندي چې د تجربې اغیزمن معلومات باید د قناعت وړ نه وي.د FFPE نمونو کیفیت په سمه توګه ارزولو لپاره، موږ باید د RIN پرته نور اندازه وکاروو.د RIN سربیره، Agilent bioanalyzer هم کولی شي د DV200 ارزښت د RNA کیفیت د ارزونې پیرامیټر په توګه محاسبه کړي.DV200 یو پیرامیټر دی چې د RNA نمونې کې د 200 bp څخه لوی ټوټې تناسب محاسبه کوي.DV200 د RIN په پرتله د FFPE نمونې کیفیت غوره شاخص دی.د FFPE لخوا استخراج شوي RNA لپاره، دا د جینونو شمیر سره خورا لوړ تړاو لري چې په اغیزمنه توګه کشف کیدی شي او د جینونو تنوع [3].که څه هم DV200 کولی شي د FFPE کیفیت کشف کې نیمګړتیاوې پوره کړي، د Agilent bioanalyzer لاهم نشي کولی د RNA نمونو کې د کیفیت ستونزې په بشپړه توګه تحلیل کړي، په شمول چې آیا په نمونو کې مخنیوی کونکي شتون لري.مخنیوی کونکي پخپله کولی شي د لاندې جریان تجربو پراخه کولو موثریت اغیزه وکړي او د ګټورو معلوماتو مقدار کم کړي.د دې لپاره چې پوه شئ چې ایا په نمونه کې مخنیوی شتون لري، موږ کولی شو د ریښتیني وخت فلوروسینټ کمیتي PCR میتود غوره کړو چې وروسته تشریح شوي.

04 د ریښتیني وخت فلوروسینټ کمیتي PCR

د ریښتیني وخت فلوروسینټ مقداري PCR میتود نه یوازې په نمونه کې مخنیوی کونکي کشف کولی شي ، بلکه د FFPE نمونې کې د RNA کیفیت په دقیق ډول منعکس کولی شي.د Agilent بیولوژیکي تحلیل کونکو سره په پرتله ، د ریښتیني وخت فلوروسینس کمیتي وسیلې د دوی پراخه غوښتنلیک له امله په لوی بیولوژیکي لابراتوارونو کې خورا مشهور دي.د RNA نمونو کیفیت ازموینې لپاره، موږ یوازې د داخلي حوالې جینونو لپاره د پریمر تحقیقاتو پیرود یا چمتو کولو ته اړتیا لرو، لکه GUSB (د بلی نمبر Hs00939627).د پرائمرونو، تحقیقاتو او معیارونو د دې سیټ په کارولو سره (د پیژندل شوي غلظت ټول RNA) د مطلق کمیتي تجربو ترسره کولو لپاره، د اغیزمن RNA ټوټه غلظت د RNA کیفیت د ارزونې معیار په توګه محاسبه کیدی شي (د لنډ لپاره فعال RNA مقدار (FRQ)).د NGS ازموینې کې، موږ وموندله چې د RNA نمونو FRQ د مؤثره معلوماتو حجم سره خورا لوړ اړیکه لري.د ټولو نمونو لپاره چې د 0.2ng/uL FRQ څخه لوی وي، لږترلږه 70٪ لوستل کولی شي په مؤثره توګه د حوالې ترتیب پوښي (شکل 4).

شکل 4، د FRQ ارزښت چې د فلوروسینس مقداري میتود لخوا کشف شوی د NGS تجربه کې ترلاسه شوي مؤثره معلوماتو سره خورا لوړ اړیکه لري (R2>0.9).سور کرښه د FRQ ارزښت دی چې د 0.2 ng/uL سره مساوي دی (log10 = -0.7).【4】

د FFPE نمونو لپاره د پلي کیدو سربیره ، د ریښتیني وخت کمیتي PCR میتود هم کولی شي په نمونو کې د مخنیوی کونکي مؤثره څارنه وکړي.موږ کولی شو هغه نمونه اضافه کړو چې د داخلي مثبت کنټرول (IPC) او د هغې ارزونې سره د عکس العمل سیسټم کې کشف شي، او بیا د Ct ارزښت ترلاسه کولو لپاره د فلوروسینس اندازه کول ترسره کړو.که چیرې د Ct ارزښت د غیر نمونې عکس العمل کې د Ct ارزښت څخه وروسته پاتې شي، دا په ګوته کوي چې مخنیوی په نمونه کې شتون لري او په غبرګون کې د لوړولو موثریت مخنیوی کوي.

05 Qubit د فلوروسینټ رنګ کولو طریقه

کیوبیټ فلورومیټر د نیوکلیک اسید غلظت او پاکوالي کشف لپاره ترټولو عام کارول شوی کوچنی وسیله ده ، کوم چې کار کول اسانه دي او نږدې په هر مالیکول بیولوژی لابراتوار کې شتون لري.دا په دقت سره د نیوکلیک اسید غلظت د کشف او د نیوکلیک اسید پابند فلوروسینټ رنګ (Qubit کشف reagent) سره محاسبه کوي.Qubit لوړ حساسیت او ځانګړتیا لري، او کولی شي په سمه توګه د RNA اندازه pg/µL غلظت ته ورسوي.د نیوکلیک اسید غلظت په دقیق ډول اندازه کولو لپاره د پیژندل شوي وړتیا سربیره ، د ترمو فشر وروستی نوی ماډل ، کیوبیټ 4.0 هم کولی شي د RNA بشپړتیا کشف کړي.د Qubit 4.0 د RNA کشف سیسټم (RNA IQ Assay) په ورته وخت کې د دوه ځانګړي فلوروسینټ رنګونو کشف کولو سره د RNA بشپړتیا کشف کوي.دا دوه فلوروسینټ رنګونه کولی شي په ترتیب سره د لویو ټوټو او د RNA کوچنۍ ټوټې سره وصل شي.دا دوه فلوروسینټ رنګونه په نمونه کې د RNA د لویو برخو تناسب په ګوته کوي، او له دې څخه د IQ (Integrity and Quality) ارزښت چې د RNA کیفیت استازیتوب کوي محاسبه کیدی شي.د IQ ارزښت د FFPE او غیر FFPE نمونو لپاره د تطبیق وړ دی، او د راتلونکي ترتیب کیفیت باندې خورا لوی نفوذ لري.د مثال په توګه د NGS تجربو اخیستل، د RNA-Seq ازموینې تجربو کې چې د Ion torrent™ پلیټ فارم کې ترسره شوي، ډیری نمونې د IQ ارزښتونو سره چې له 4 څخه ډیر دي لږ تر لږه 50٪ اغیزمن لوستل لري (شکل 5).د پورته ذکر شوي کشف میتودونو سره پرتله کول ، د Qubit IQ Assay نه یوازې د کار کولو لپاره خورا اسانه دی او لږ وخت نیسي (په پنځو دقیقو کې) ، بلکه د اندازه شوي پیرامیټر IQ ارزښت او د لاندې جریان تجربو ډیټا کیفیت ترمینځ عالي اړیکه هم لري.

شکل 5، د Qubit RNA IQ ارزښت او د RNA-Seq نقشه شوي لوستلو ترمنځ خورا ښه اړیکه شتون لري.【5】

د پورته پیژندنې له لارې، زه باور لرم چې هرڅوک د RNA کیفیت کنټرول مختلف میتودونو په اړه کافي پوهه لري.په عمل کې، تاسو کولی شئ غوره کړئد نمونې ډول او موجوده وسیلو مطابق اړوند میتود.یوازې د RNA کیفیت کنټرولولو سره موږ کولی شو د نمونې ضعیف کیفیت له امله د راتلونکو تجربو ناکامۍ څخه مخنیوی وکړو، پدې توګه قیمتي وخت، انرژي او لګښت خوندي کوو.

د حوالې محصولات:

د څارویو ټول RNA جلا کولو کټ

د Cell Total RNA Isolation Kit

حوالې

【1】شروډر، A.، Mueller، O.، Stocker، S. et al.RIN: د RNA اندازه کولو لپاره د بشپړتیا ارزښتونو ټاکلو لپاره د RNA بشپړتیا شمیره.BMC مالیکولر بایول 7، 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】د انسان د معافیت د څارنې د کارونکي لارښود (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA for Archival Formalin- Fixed Paraffin- Embedded Tissue Samples, volumological Sciences, Page 01, Volumeological Sciences, 201 Page 357-373https://doi.org/10.1093/toxsci/