1. لومړنی تفاهم

پدې مرحله کې، موږ باید په ځینو مفاهیمو او اصطلاحاتو پوه شو، ترڅو د خپلو مشرانو په وړاندې د غلطیو څخه مخنیوی وکړو، لکه:

پوښتنه: د RT-PCR، qPCR، ریښتیني وخت PCR، او ریښتیني وخت RT-PCR ترمنځ څه توپیر دی؟

ځواب: RT-PCR د ریورس ټرانسکرپشن PCR دی(ریورس ټرانسکرپشن PCR، RT-PCR)، کوم چې د پولیمیریز چین غبرګون (PCR) په پراخه کچه کارول کیږي.په RT-PCR کې، د RNA سټرنډ په بشپړونکي DNA کې نقل شوی، چې بیا د PCR لخوا د DNA پراخولو لپاره د نمونې په توګه کارول کیږي.
په ریښتیني وخت کې PCR او qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) یو شی دی، دواړه د ریښتیني وخت کمیتي PCR دي، پدې معنی چې د PCR هر دور د ریښتیني وخت ډیټا ریکارډونه لري، نو د پیل شوي ټیمپلیټونو شمیر دقیق تحلیل تنظیم کیدی شي.

که څه هم دواړه د ریښتیني وخت PCR (ریښتیني وخت فلوروسینټ مقداري PCR) او ریورس ټرانسکرپشن PCR (ریورس ټرانسکرپشن PCR) د RT-PCR په توګه لنډیز بریښي ، نړیوال کنوانسیون دا دی: RT-PCR په ځانګړي توګه د ریورس لیږد ته اشاره کوي.PCR ، د ریښتیني وخت PCR عموما د qPCR په توګه لنډیز کیږي (کمیتي ریښتیني وخت PCR).

او د ریښتیني وخت RT-PCR (RT-qPCR) ، دا د فلوروسینټ کمیتي ټیکنالوژۍ سره یوځای د برعکس لیږد PCR دی: لومړی د RNA ریورس لیږد څخه cDNA (RT) ترلاسه کړئ، او بیا د کمیتي تحلیل (qPCR) لپاره ریښتیني وخت PCR وکاروئ.ډیری لابراتوارونه RT-qPCR ترسره کوي، یعني د RNA د بیان کمولو په اړه څیړنه کوي، نو هغه qPCR چې هرڅوک یې په لابراتوار کې خبرې کوي په حقیقت کې RT-qPCR ته اشاره کوي، مګر دا مه هېروئ چې لاهم په کلینیکي غوښتنلیکونو کې د DNA ډیری ازموینې شتون لري.کمیتي تحلیل، لکه د هیپاتیت بی ویروس HBV کشف.

پوښتنه: د ډیری فلوروسینټ مقداري PCR لوستلو وروسته ، ولې باید پراخه شوې ټوټه د 80-300bp حد کې کنټرول شي؟

ځواب: د هر جین ترتیب اوږدوالی توپیر لري، ځینې یې څو kb دي، ځینې یې په سلګونو bp دي، مګر موږ یوازې اړتیا لرو چې د محصول اوږدوالی 80-300bp وي کله چې پرائمر ډیزاین کړئ، ډیر لنډ یا ډیر اوږد د فلوروسینټ کمیتي PCR کشف لپاره مناسب ندي.د محصول ټوټه ډیره لنډه ده چې د پریمر - ډیمر څخه توپیر شي.د پرائمر-ډیمر اوږدوالی د 30-40bp په اړه دی، او دا ستونزمنه ده چې توپیر وکړي چې آیا دا یو پرائمر-ډیمر دی یا محصول که دا د 80bp څخه کم وي.که د محصول ټوټه ډیره اوږده وي، د 300bp څخه ډیر وي، دا به په اسانۍ سره د ټیټ لوړولو موثریت المل شي او نشي کولی په اغیزمنه توګه د جین اندازه معلومه کړي.

د مثال په توګه، کله چې تاسو حساب کړئ چې په ټولګي کې څومره خلک دي، تاسو یوازې اړتیا لرئ چې څومره خولې شتون ولري.همغه ریښتیا ده کله چې تاسو جینونه کشف کړئ ، تاسو اړتیا لرئ یوازې د جین یو ټاکلی ترتیب کشف کړئ ترڅو استازیتوب وکړي ټوله ترتیب به ترسره کړي.که غواړې چې خلک وشمېرل شې، نو د خولې، پوزې، غوږونو او عینکو دواړو حساب کول پکار دي، چې تېروتنه یې اسانه ده.

د پراخولو لپاره، په بیولوژیکي څیړنو کې، د ساحې څخه تر ساحې پورې ډیرې څیړنې شتون لري، ځکه چې د هر ډول ژانر د جین ترتیب خورا اوږد دی، دا غیر ضروري او ناشونې ده چې ټولې ټوټې اندازه کړي، لکه د باکتریا 16S ترتیب، چې د باکتریا محافظه کار ترتیب ترسره کوي ترڅو د یو ځانګړي نفوس شمیره معلومه کړي.

پوښتنه: د qPCR پریمر ډیزاین لپاره مطلوب اوږدوالی څومره دی؟

ځواب: په عموم ډول، د پریمر اوږدوالی شاوخوا 20-24bp دی، کوم چې غوره دی.البته، موږ باید د پریمر ډیزاین کولو پر مهال د پریمر TM ارزښت ته پام وکړو، ځکه چې دا د مطلوب انیل کولو تودوخې پورې اړه لري.د ډیرو تجربو وروسته، دا ثابته شوه چې 60 ° C یو ښه TM ارزښت دی.که د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه وي ، نو دا به په اسانۍ سره د غیر مشخص لوړولو لامل شي.که د انیل کولو تودوخه خورا لوړه وي ، د امپلیفیکیشن موثریت به نسبتا ټیټ وي ، د امپلیفیکیشن وکر چوکۍ به وروسته پیل شي ، او د CT ارزښت به وځنډول شي.

پوښتنه: د رنګ کولو طریقه څنګه د تحقیقاتو میتود څخه توپیر لري؟

ځواب: د رنګ کولو طریقهځینې ​​فلوروسینټ رنګونه لکه SYBR شنه Ⅰ، PicoGreen، BEBO او داسې نور، په خپله رڼا نه خپروي، مګر د دوه اړخیزه DNA کوچني نالی سره تړلو وروسته به فلوروسینټ خارج کړي.نو ځکه، د PCR غبرګون په پیل کې، ماشین نشي کولی د فلوروسینټ سیګنال کشف کړي.کله چې عکس العمل د annealing-extension مرحلې ته ورسیږي، دوه ګونی سټنډ پرانیستل کیږي، او یو نوی سټینډ د DNA پولیمیریز عمل الندې ترکیب کیږي، او د فلوروسینټ مالیکول د dsDNA کوچني نالی سره تړل کیږي.لکه څنګه چې د PCR سایکلونو شمیر ډیریږي ، ډیر او ډیر رنګونه د ډبل سټنډ شوي DNA سره یوځای کیږي ، او د فلوروسینټ سیګنال هم په دوامداره توګه وده کوي.د رنګ کولو طریقه په عمده توګه په ساینسي څیړنو کې کارول کیږي.
PS: محتاط اوسئ کله چې تجربه وکړئ ، رنګ باید د انسان DNA سره یوځای شي ، محتاط اوسئ چې دا په فلوروسینټ شخص بدل شي.

د رنګ کولو طریقه (کیڼ اړخ ته) د تحقیقاتو طریقه (ښي)
PS: محتاط اوسئ کله چې تجربه وکړئ ، رنګ باید د انسان DNA سره یوځای شي ، محتاط اوسئ چې دا په فلوروسینټ شخص بدل شي.

SYBR شنه Ⅰ د DNA کوچنۍ نالی سره تړلی دی

د تفتیش طریقهتاقمان پروب د هایدرولیسز تحقیقاتو ترټولو عام کارول کیږي.د تحقیقاتو په 5′ پای کې د فلوروسینټ ګروپ شتون لري، معمولا FAM، او تحقیقات پخپله د هدف جین بشپړونکي ترتیب دی.په 3′ پای کې د فلوروسینټ قندونکې ډله شتون لري.د فلوروسینټ ریزونانس انرژی لیږد د اصولو له مخې (Förster resonance energy transfer, FRET) ، کله چې د ریپورټر فلوروسینټ ګروپ (ډونر فلوروسینټ مالیکول) او د شنډولو فلوروسینټ ګروپ (د منلو وړ فلوروسینټ مالیکول) په جوش کې وي کله چې سپیکٹرا ډیریږي او فاصله د excitor 100m سره نږدې کیږي. د منلو وړ مالیکول فلوروسینس، پداسې حال کې چې آٹو فلوروسینس کمزوری شوی.له همدې امله، د PCR غبرګون په پیل کې، کله چې تحقیقات په سیسټم کې وړیا او ثابت وي، د راپور ورکوونکي فلوروسینټ ګروپ به فلوروسینټ نه جذبوي.کله چې annealing کیږي، پریمر او پروب د ټیمپلیټ سره تړل کیږي.د تمدید مرحلې په جریان کې، پولیمیریز په دوامداره توګه نوي زنځیرونه ترکیب کوي.DNA پولیمریز 5′-3′ exonuclease فعالیت لري.کله چې تحقیقاتو ته ورسیږو، د DNA پولیمیریز به د ټیمپلیټ څخه تحقیقات هایډرولیز کړي، د ریپورټر فلوروسینټ ګروپ د قوینر فلوروسینټ ګروپ څخه جلا کړي، او د فلوروسینټ سیګنال خوشې کړي.څرنګه چې د تحقیقاتو او ټیمپلیټ ترمنځ یو له بل سره اړیکه شتون لري، د تحقیقاتو طریقه د ډای میتود څخه د ازموینې د دقت او حساسیت له مخې غوره ده.د تحقیقاتو میتود په عمده توګه د تشخیص لپاره کارول کیږي.

پوښتنه: مطلق مقدار څه شی دی؟نسبي مقدار څه شی دی؟

ځواب: مطلق مقدار د نمونې د لومړني کاپي شمیرې محاسبه ته اشاره کوي چې د qPCR لخوا معاینه کیږي، لکه څومره چې د HBV ویروسونه په 1ml وینه کې دي.د نسبي مقدار کولو له لارې ترلاسه شوې پایله د یوې ځانګړې نمونې د هدف جین مقدار کې د بلې حوالې نمونې په پرتله بدلون دی، او د جین بیان لوړ تنظیم شوی یا ښکته تنظیم شوی.

پوښتنه: ایا د RNA استخراج مقدار، د نقل نقل کولو موثریت، او د لوړولو وړتیا به په تجربوي پایلو اغیزه وکړي؟
پوښتنه: ایا د نمونې ذخیره کول، د استخراج ریجنټونه، د بیرته راګرځیدونکي لیږد ریجنټونه، او د رڼا لیږدونکي مصرف کونکي د تجربو پایلې اغیزه کوي؟
پوښتنه: کوم میتود کولی شي د تجربې ډاټا سم کړي؟

د دې مسلو په اړه، موږ به یې په لاندې پرمختللو او پرمختللو برخو کې په تفصیل سره بیان کړو.
2. پرمختللی پوهه

د ریښتیني وخت فلوروسینټ کمیتي PCR په اړه ، موږ باید دا حقیقت وپیژنو چې هر کال په زرګونو ساینسي څیړنیزې مقالې خپریږي ، چې پدې کې د فلوروسینټ مقداري PCR ټیکنالوژي لږه شمیره نه ده.

که چیرې د فلوروسینټ کمیتي PCR تجربې اندازه کولو لپاره کوم عام معیار شتون ونلري، پایلې ممکن په پراخه کچه توپیر ولري.د ورته نسل د ورته جین لپاره، د ورته پروسس کولو میتود سره، د کشف پایلې به په پراخه کچه توپیر ولري، او دا به ستونزمن وي چې د وروستیو پایلو بیا تکرار کړي.تاسو هیڅوک نه پوهیږي چې کوم سم دی او کوم غلط.

ایا د دې معنی دا ده چې د فلوروسینټ کمیتي PCR د چلولو ټیکنالوژي یا غیر باوري ټیکنالوژي ده؟نه، دا ځکه چې د فلوروسینټ کمیتي PCR ډیر حساس او ډیر درست دی، او یو څه غلط عملیات به په بشپړه توګه مخالف پایلې تولید کړي.یو کوچنی زیان زر میله لرې دی.د مقالې لیکوال ممکن په مکرر ډول د بیاکتونکو لخوا شکنجه شي.په ورته وخت کې، د ژورنال بیاکتونکي هم ستونزمن دي چې د مختلفو تجربو پایلو څخه غوره کړي.

په ټوله کې، د ریښتیني وخت PCR تجربو کې د اجماع نشتوالي ته اشاره کوي.د دې لپاره، په صنعت کې لوړ پوړو ساینس پوهانو د معیارونو په جوړولو پیل وکړ،مرسته کونکو ته اړتیا لري چې د دې معیارونو پوره کولو لپاره په مقاله کې ځینې اړین تجربې او ډیټا پروسس کولو توضیحات (د اړینو معلوماتو په شمول) چمتو کړي.

بیاکتونکي کولی شي د دې توضیحاتو په لوستلو سره د تجربې کیفیت قضاوت وکړي؛راتلونکي لوستونکي هم کولی شي دا تجربه تکرار کړي یا تجربه ښه کړي.بیا په دې طریقه ترلاسه شوي تجربې پایلې د معلوماتو څخه ډکې، لوړ کیفیت، او د کارولو وړ دي.

MIBBI (د بیولوژیکي او بایو میډیکل تحقیقاتو لپاره لږترلږه معلومات -http://www.mibbi.org) منځ ته راغله.MIBBI یوه پروژه ده چې د تجربو لپاره معیارونه چمتو کوي.دا په طبیعت کې خپور شوی.دا پروژه د مختلفو بیولوژیکي تجربو موخه ده، پشمول د حجرو بیولوژي، مایکروری، qPCR چې موږ یې اوس بحث کوو، او داسې نور، او د هر ډول تجربې لپاره چمتو کوي کله چې د نسخې سپارلو لپاره.دا معلومات باید هر وخت چمتو شي.

د MIBBI پروژه کې، د فلوروسینټ کمیتي PCR پورې اړوند دوه مقالې شتون لري، یعنې:
RDML (د ریښتیني وخت PCR ډیټا مارک اپ ژبه) – د ریښتیني وخت کمیتي PCR ډیټا لپاره د جوړښت ژبه او راپور ورکولو لارښود؛
MIQE (د کمیتي ریښتیني وخت PCR تجربو خپرولو لپاره لږترلږه معلومات) - د ریښتیني وخت کمیتي PCR تجربو په اړه د مقالو خپرولو لپاره لږترلږه معلومات.
لومړی، راځئ چې د RDML په اړه وغږیږو، د اصطلاحاتو ځانګړتیا.

که چیرې د هر څه لپاره معیاري تعریف شتون ونلري، نو بحث ته دوام ورکول ناشونی دی، له همدې امله په ازموینه کې د شرایطو تشریح خورا مهم دی.
د فلوروسینټ کمیتي PCR تجربې کې کارول شوي اصطلاحات لاندې مینځپانګې شاملې دي.کیګین زموږ لپاره غوره لنډیز چمتو کړی دی.لاندې ټول وچ ديتوکي .

امپلیفیکیشن وکر
امپلیفیکیشن وکر د PCR پروسې په جریان کې رامینځته شوي وکر ته اشاره کوي ، د سایکل شمیره د abscissa په توګه او د عکس العمل په جریان کې د ریښتیني وخت فلوروسینس شدت د آرډینیټ په توګه.

یو غوره امپلیفیکیشن وکر باید لاندې ځانګړتیاوې ولري: اساسی کرښه فلیټ یا یو څه کمه ده، او د پورته کیدو کوم څرګند رجحان شتون نلري؛د منحني انفلیکشن نقطه روښانه ده، او د اضافې مرحلې سلپ د لوړولو موثریت سره متناسب دی.هرڅومره چې سلیپ ډیر وي ، هومره د لوړولو موثریت لوړ وي؛د ټولیز امپلیفیکیشن وکر موازي ښه دی، دا په ګوته کوي چې د هر ټیوب د پراخولو موثریت ورته دی؛د ټيټ غلظت نمونو د امپلیفیکیشن وکر اضطراري مرحله څرګنده ده.

اساسی کرښه (بیس لاین)
اساسی کرښه د ابتدایی دورې د شور کچه ده، معمولا د دریم او 15 دورې ترمینځ اندازه کیږي ، ځکه چې د امپلیفیکیشن محصول لخوا رامینځته شوي د فلوروسینس ارزښت زیاتوالی پدې دوره کې نشي کشف کیدی.د بیس لاین محاسبه کولو لپاره کارول شوي دورې شمیره کیدی شي توپیر ولري او که چیرې د لوړې نمونې مقدار کارول کیږي یا د هدف جین بیان کچه لوړه وي نو کمولو ته اړتیا لري.

د بیس لاین ترتیب کول د لینریت امپلیفیکیشن وکر څخه د فلوروسینس ډیټا لیدلو ته اړتیا لري.بیس لاین ترتیب شوی ترڅو د امپلیفیکیشن وکر وده د بیس لاین دورې پورتنۍ شمیرې څخه لوی د سائیکل شمیر سره پیل شي.د هر هدف ترتیب لپاره اساسات باید په انفرادي ډول تنظیم شي.د اوسط فلوروسینس ارزښتونه چې په لومړیو دورو کې کشف شوي باید په پراخه شوي محصولاتو کې ترلاسه شوي فلوروسینس ارزښتونو څخه کم شي.د مختلف ریښتیني وخت PCR سافټویر وروستي نسخې د انفرادي نمونو لپاره د بیس لاین تنظیماتو اتوماتیک اصلاح کولو ته اجازه ورکوي.

د PCR امپلیفیکیشن عکس العمل په لومړیو څو دورو کې، د فلوروسینس سیګنال ډیر بدلون نه کوي.یوې مستقیمې کرښې ته رسیدل د بیس لاین په نوم یادیږي، مګر که موږ په لومړیو څو پړاوونو کې له نږدې وګورو، موږ وینو چې د بیس لاین دننه هغه څه دي چې په لاندې انځور کې پیښیږي.

پس منظر پس منظر ته اشاره کوي
په غبرګون کې د غیر مشخص فلوروسینس ارزښتد مثال په توګه: غیر موثر فلوروسینس قوی کول؛یا د SYBR ګرین کارولو له امله د ډبل سټنډ شوي DNA ټیمپلیټونو لوی شمیر.د سیګنال شالید اجزا په ریاضي ډول د ریښتیني وخت PCR سافټویر الګوریتم لخوا لرې شوي.

خبریال سیګنال
د راپور ورکوونکي سیګنال د ریښتیني وخت PCR په جریان کې د SYBR شنه یا فلوروسینټ لیبل شوي ترتیب ځانګړي تحقیقاتو لخوا رامینځته شوي فلوروسینټ سیګنال ته اشاره کوي.

نورمال شوي خبریال سیګنال (RN)
RN د راپور ورکوونکي رنګ د فلوروسینس شدت ته اشاره کوي چې په هر دور کې اندازه شوي د غیر فعال حواله رنګ د فلوروسینس شدت لخوا ویشل شوي.

غیر فعال حواله رنګ
په ځینو ریښتیني وخت PCRs کې،د فلوروسینټ ډای ROX د فلوروسینټ سیګنال نورمال کولو لپاره د داخلي حوالې په توګه کارول کیږي.دا د ناسم پایپټینګ، څاه موقعیت، او د څاه په اساس د فلوروسینس تغیراتو له امله د تغیراتو لپاره سم کوي.

د فلوروسینس حد (د حد)
د شالید ارزښت څخه پورته تنظیم شوی او د پام وړ د امپلیفیکیشن وکر د پلیتو ارزښت لاندې.دا باید د امپلیفیکیشن وکر په خطي سیمه کې پروت وي، د PCR کشف د لاګ-لینیر رینج استازیتوب کوي.حدونه باید د log-amplification curve لید کې تنظیم شي ترڅو د PCR د log-linear مرحله په اسانۍ سره د پیژندلو وړ وي.که چیرې په ریښتیني وخت PCR کې ډیری هدف لرونکي جینونه شتون ولري ، نو حد باید د هر هدف لپاره ټاکل شي.عموما، د PCR عکس العمل د لومړیو 15 دورو فلوروسینس سیګنال د فلوروسینس شالید سیګنال په توګه کارول کیږي ، او د فلوروسینس حد د PCR د لومړیو 3 څخه تر 15 دورو کې د فلوروسینس سیګنال معیاري انحراف 10 ځله دی ، او د فلوروسینس حد د PCR امپلیفیکیشن مرحلې کې ټاکل شوی.په عموم کې، هر وسیله د کارولو دمخه د فلوروسینس حد لري.

د سایکل حد (CT) یا د کراس کولو نقطه (CP)
هغه دوره په کوم کې چې د امپلیفیکیشن وکر د حد څخه تیریږي (د بیلګې په توګه، هغه نقطه چې د فلوروسینس کشف د پام وړ وده کوي).CT کیدای شي یوه برخه وي او د پیل شوي ټیمپلیټ اندازه محاسبه کیدی شي.د CT ارزښت د هغه دورې شمیره څرګندوي چې تجربه شوي کله چې د هر PCR عکس العمل ټیوب کې د فلوروسینټ سیګنال ټاکل شوي حد ته ورسیږي.د هرې کينډۍ د CT ارزښت او د کينډۍ د لومړني کاپي شمېرې لوګاريتم ترمنځ يو خطي اړيکه شتون لري،د لومړني کاپي شمیره لوړه، د CT ارزښت کوچنی، او برعکس.یو معیاري وکر د پیژندل شوي لومړني کاپي شمیرې سره د معیار په کارولو سره رامینځته کیدی شي ، چیرې چې abscissa د CT ارزښت استازیتوب کوي ، او آرډینیټ د لومړني کاپي شمیرې لوګاریتم استازیتوب کوي.له همدې امله، تر هغه چې د نامعلوم نمونې CT ارزښت ترلاسه شي، د نمونې لومړنۍ کاپي شمیره د معیاري وکر څخه محاسبه کیدی شي.

ΔCT ارزښت
د ΔCT ارزښت تشریح کويد هدف جین او د اړونده endogenous حوالې جین CT ارزښت ترمنځ توپیر، لکه د کور ساتلو جین، او د کارول شوي ټیمپلیټ مقدار نورمال کولو لپاره کارول کیږي:
⇒ΔCT = CT (د هدف جین) - CT (د انډروجینس حواله جین)

د ΔΔCT ارزښت
د ΔΔCT ارزښت د ګټو نمونې د ΔΔCT ارزښت (د مثال په توګه، محرک حجرې) او د حوالې نمونې د ΔΔCT ارزښت (د مثال په توګه، غیر محرک حجرې) ترمنځ توپیر بیانوي.د حوالې نمونې ته د کیلیبریشن نمونه هم ویل کیږي او نورې ټولې نمونې د نسبي مقدار لپاره دې ته نورمال کیږي:
⇒ΔΔCT = اوسط ΔCT (د ګټو نمونه) - اوسط ΔCT (د حوالې نمونه)

Endogenous Reference genes (د انډروجینس حوالې جینونه)
د داخلي حوالې جینونو د بیان کچه، لکه د کور ساتنې جینونه (د کور ساتنې جینونه)، د نمونو ترمنځ توپیر نلري.د هدف جین سره د حوالې جین د CT ارزښتونو پرتله کول د هدف جین د بیان کچه ته اجازه ورکوي چې د ان پټ RNA یا cDNA مقدار ته نورمال شي (پورته د ΔCT ارزښتونو برخه وګورئ).

د داخلي حوالې جینونه سم ديد RNA احتمالي تخریب یا د RNA نمونو کې د انزایم مخنیوی کونکو شتون ، او همدارنګه د RNA مینځپانګې کې تغیرات ، د نقل لیږد موثریت ، د نیوکلیک اسید بیا رغونه ، او د نمونې اداره کول.د غوره حوالې جین (جینونو) غوره کولو لپاره، موږ الګوریتم تعدیل کړی ترڅو اجازه ورکړي چې د غوره حوالې انتخاب په تجربوي ترتیب پورې اړه ولري.

داخلي کنټرول
د کنټرول سلسله چې د هدف ترتیب په څیر ورته عکس العمل کې پراخه شوې او د مختلف تحقیقاتو سره پلټل کیږي (د بیلګې په توګه د ډوپلیکس PCR ترسره کول).داخلي کنټرولونه اکثرا د ناکامو امپریفیکیشنونو د راجلبولو لپاره کارول کیږي، لکه کله چې د هدف ترتیب نه وي کشف شوی.
د کیلیبریشن نمونه
د حوالې نمونه (د مثال په توګه، د حجرې له کرښې یا نسج څخه پاک شوی RNA) په نسبي مقدار کې کارول کیږي ترڅو د نورو ټولو نمونو پرتله کړي ترڅو د جین د نسبي بیان کچه معلومه کړي.د کیلیبریشن نمونه کیدای شي هر ډول نمونه وي، مګر معمولا یو کنټرول وي (د بیلګې په توګه، د تجربې د صفر وخت څخه یوه نمونه یا درملنه نه کیږي).

مثبت کنټرولونه
د کنټرول عکس العمل وکاروئد نمونې معلوم مقدار.مثبت کنټرولونه اکثرا د دې لپاره کارول کیږي چې وګوري چې د پریمر سیټ یا پریمر – تحقیقاتي سیټ په سمه توګه کار کوي او عکس العمل په سمه توګه تنظیم شوی.

د کينډۍ کنټرول نشته (NTC)
د کنټرول عکس العمل چې د امپلیفیکیشن عکس العمل ټولې اړینې برخې لري پرته له ټیمپلیټ ، کوم چې معمولا د اوبو سره بدلیږي.د NTC کارول کولی شي ککړتیا ومومي چې د ریجنټ ککړتیا یا بهرني DNA له امله رامینځته کیږي ، پدې توګه د کشف ډیټا اعتبار او اعتبار تضمینوي.د NTC کنټرول پراخول ککړتیا په ګوته کوي.

د RT کنټرول نشته (NRT)
د RNA استخراج پروسه ممکن د پاتې جینومیک DNA ولري، کوم چې خورا زیانمن دی او مجرم دی چې د معلوماتو کیفیت او د qPCR طبیعي دښمن اغیزه کوي، نو کله چې د تجربو ډیزاین کول، دا باید یوازې د RNA کشف کولو لپاره ډیزاین شي.دوه لارې شتون لري، یو یې د انټرونونو په اوږدو کې د پرائمر ډیزاین کول دي، بل یې په بشپړه توګه د DNA لرې کول دي، کوم چې غوره دي، چې وروسته به یې بحث وشي.د NTR کنټرول د DNA ککړتیا کشف کولو لپاره یو جادو عکس دی.که چیرې پراخوالی شتون ولري، دا پدې مانا ده چې ککړتیا شتون لري.

معیارونه
معیارونه د پیژندل شوي غلظت یا کاپي شمیرې نمونې دي چې د معیاري وکر جوړولو لپاره کارول کیږي.د معیاري ثبات د یقیني کولو لپاره، د جین ټوټه معمولا په پلازمیډ کې کلون کیږي او د معیار په توګه کارول کیږي.

معیاري وکر
معمولا د دوه چنده کولو تناسب سره سم د معیاري محصول سره لږترلږه 5 غلظت ګریډینټونو کې مینځل کیږي ، او 5 ټکي د CT ارزښت او کاپي شمیره همغږي کې راښکته کیږي ، او ټکي د معیاري وکر رامینځته کولو لپاره د کرښې په جوړولو سره وصل شوي.د هر معیاري وکر لپاره، د هغې اعتبار باید وڅیړل شي.د سلیپ ارزښت د -3.3 او -3.8 ترمنځ راځي، او هر غلظت په درې اړخیزه توګه ترسره کیږي.هغه ټکي چې د نورو ټکو څخه د پام وړ توپیر لري باید له مینځه یوړل شي.د ازموینې لپاره د نمونې CT ارزښت په معیاري وکر کې راوړل کیږي، او د ازموینې لپاره د نمونې د بیان کچه محاسبه کیدی شي.

د ازموینې لپاره د نمونې CT ارزښت په معیاري وکر کې راوړل کیږي، او د ازموینې لپاره د نمونې لومړني کاپي شمیره محاسبه کیدی شي.

موثریت او سلپ
د معیاري وکر سلپ د ریښتیني وخت PCR موثریت څرګندوي.
د -3.322 سلپ دا په ګوته کوي چې د PCR امپلیفیکیشن موثریت 1 یا 100٪ موثر دی، او د PCR محصول اندازه په هر دور کې دوه چنده کیږي.
· له –3.322 څخه کم سوری (د مثال په توګه –3.8) د PCR موثریت په ګوته کوي
· له –3.322 څخه لوی سلیپ (د مثال په توګه –3.0) دا په ګوته کوي چې د PCR موثریت له 100٪ څخه ډیر ښکاري، کوم چې د حیرانتیا خبره ده، د PCR یوه دوره څنګه کولی شي د تولید شوي محصول دوه چنده څخه ډیر تولید کړي؟دا حالت د PCR عکس العمل په غیر خطي مرحله کې پیښیږي ، دا د غیر مشخص پراخه کولو لوی مقدار شتون لري.

منحنی منحنی
وروسته له دې چې د qPCR امپلیفیکیشن بشپړ شي، د PCR محصول تودوخه کیږي.لکه څنګه چې د تودوخې لوړیږي، د دوه اړخیزه امپلیفیکیشن محصول په تدریجي ډول منحل کیږي، په پایله کې د فلوروسینس شدت کمیږي.کله چې یو ټاکلی تودوخې (Tm) ته ورسیږي، د محصولاتو لوی شمیر به وچ شي.فلوروسینس په چټکۍ سره راټیټیږي.د PCR مختلف محصولات مختلف Tm ارزښتونه او د خټکي مختلف تودوخې لري ، نو د PCR ځانګړتیا پیژندل کیدی شي.

د خړوبولو منحنی ( مشتق منح )
د خټکي وکر د لوړ نقشه جوړولو لپاره اخیستل شوی، کوم چې کولی شي د PCR محصولاتو ټوټو وضعیت په ډیر ښه ډول ښکاره کړي.څرنګه چې د خټکي تودوخې د DNA ټوټې د Tm ارزښت دی، ځینې پیرامیټرونه چې د DNA ټوټې د Tm ارزښت اغیزه کوي قضاوت کیدی شي، لکه د ټوټې اندازه، د GC مینځپانګې، او نور. په عمومي توګه، زموږ د پریمر ډیزاین اصولو سره سم،د پراخ شوي محصول اوږدوالی د 80-300bp په حد کې دی، نو د خټکي تودوخه باید د 80 درجو او 90 درجو ترمنځ وي.

د خټکي منحني تفسیر: که چیری یوازینی عمده څوکه د 80°C-90°C په منځ کی ښکاره شی، دا په دی معنی ده چی د فلوروسینټ کمیتی PCR کامل دی؛که اصلي څوکه د 80°C-90°C تر منځ ښکاره شي او متفرقه څوکې د 80°C څخه ښکته ښکاري، د پرائمر ډیمر اساسا په پام کې نیول کیږي.تاسو کولی شئ د حل کولو لپاره د انیل کولو تودوخې لوړولو هڅه وکړئ؛که اصلي څوکه د 80°C-90°C تر منځ ښکاره شي، او متفرقه څوکه بیا د تودوخې لوړیدو په وخت کې څرګندیږي، دا اساسا په پام کې نیول کیږي چې د DNA ککړتیا شتون لري، او DNA باید د تجربې په لومړي مرحله کې لرې شي.

البته، لاهم ځینې غیر معمولي حالتونه شتون لري، کوم چې به یو یو لاندې مات شي.
3. پرمختللې پوهه

د qPCR کولو لپاره، زه باید MIQE ووایم،لږترلږه معلوماتد خپرولو لپارهکمیتید ریښتیني وخت PCRتجربې - د ریښتیني وخت کمیتي PCR په اړه د مقالو خپرولو لپاره لږترلږه معلوماتتجربېد هرچا د پوهاوي ساده کولو لپاره، موږ به کلیدي محتويات ساده کړو.

تاسو کولی شئ په انټرنیټ کې د MIQE اصلي متن وپلټئ، او ترټولو مهمه خبره دا ده چې دا دد معلوماتو چک لیست چې د مقالې خپرولو پرمهال چمتو کولو ته اړتیا لري .

بیاکتونکي کولی شي د دې توضیحاتو په لوستلو سره د تجربې کیفیت قضاوت وکړي؛راتلونکي لوستونکي هم کولی شي دا د تجربې تکرار یا ښه کولو لپاره وکاروي.
د یادولو وړ ده چې پدې لیست کې د هر لیست اهمیت په ترتیب سره E یا D سره نښه شوی.دا څه معنی ورکوي؟E: اړین معلومات (باید وسپارل شي)؛D: مطلوب معلومات (د امکان تر حده چمتو کړئ).

MIQE (1) - تجربوي ډیزاین
ډیری بدمعاشان چې د فراغت زده کړې پای ته رسیدو وروسته یې خپله دفاع بشپړه کړې وي نه پوهیږي چې څنګه په خپلواکه توګه تجربه ډیزاین کړي، خپل نوټ بوک خلاص کړي، او هغه څه وکړي چې ښوونکي ورته ووایي.د پایلې په توګه، د تجربې ډیزاین سخت نه و، او د مجلې اداری څانګې وویل چې دوی غوښتل دا انځور او دا انځور جوړ کړي، نو دوی دا کار په تیاره کې وکړ.دا ډول غله جوړیږي!

کور ته نږدې، د تجربې لومړی اصول ټاکل کیږيد تجربوي منطق سختۍ.تر ټولو اساسي شی د تجربوي ډیزاین دی، او د تجربوي ډیزاین په اړه خورا مهم شی دا دی چې څنګه د هدف نمونه، د حوالې نمونه (کنټرول)، او د تکرار شمیره ترتیب کړئ، ترڅو تجربه لرونکي ډاټا حواله، پرتله کولو او قانع کولو وړ وي.

د هدف نمونههغه نمونې ته اشاره کوي چې موږ ته اړتیا لري چې د یوې ټاکلې درملنې وروسته د هدف جین کشف کړو.د حوالې نمونهپرته د درملنې نمونه ده، کوم چې ډیری وختونه په بیولوژي کې وحشي ډول ته ویل کیږي.

تجربی نقلونهډیر مهم دي.عموما، د هڅونکي نقلونو شمیر باید له دریو څخه ډیر وي.دا اړینه ده چې توپیر وکړو چې بیولوژیکي نقل څه شی دی او تخنیکي نقل څه شی دی.

بیولوژیکي نقلونه: د بیالبیلو موادو (وخت، بوټو، بستونو، غبرګون پلیټونو) سره د ورته تایید تجربه ترسره شوې.

بیولوژیکي نقل
راځئ چې د مثال په توګه د مرچ د آفت وژونکو درملنه واخلو.موږ غواړو د ABC په دریو بوټو باندې آفت وژونکي سپری کړو، بیا د ABC درې نباتات درې بیولوژیکي نقلونه دي، او دا د ورته تصدیق تجربه ده چې د مختلفو موادو سره ترسره کیږي.مګر د تجربې په توګه، یو کنټرول ضرور اړین دی، نو موږ کولی شو د نبات A څخه یوه څانګه د نبات A تجربوي ګروپ جوړولو لپاره سپری کړو، او د کنټرول ګروپ جوړولو لپاره د نبات A نورو څانګو سپری نه کړو.د B او C لپاره ورته کار وکړئ.

تخنیکي نقلونه (تخنیکي نقلونه): دا یوه تکراري تجربه ده چې د عملیاتو له امله رامینځته شوي غلطیو څخه مخنیوي لپاره ډیزاین شوې ، کوم چې په حقیقت کې یو نقل سوری دی چې په ورته موادو کې شامل دی.دواړه علاجونه او کنټرولونه باید د هدف جین او داخلي حوالې جین نقل کولو ترتیبات (لږترلږه درې) ولري.

تخنیکي تکرار
بیا د مثال په توګه د آفت وژونکو سره درملنه شوي مرچ واخلئ.د نبات A تجربوي ګروپ لپاره، موږ د هدف جین او داخلي حوالې جین لپاره په ترتیب سره د 1، 2، او 3 درې PCR سوراخ جوړ کړل، ترڅو د کشف وروسته اوسط واخلئ.د نبات د کنټرول لپاره A ګروپونه هم په ورته ډول درملنه کیږي.همدا ډول د B او C نباتاتو لپاره ورته درملنه وکړئ.دا تخنیکي تکرار دی.

د یادولو وړ ده چېهغه څه چې احصایې ته ننوځي بیولوژیکي تکرار دی، او تخنیکي تکرار دا دی چې دا ازموینه وکړي چې آیا په تجربوي بهیر کې کوم تصادفي پیښې شتون لري، ترڅو د تجربې پایلې د اعتبار وړ وي، دا د دې لپاره چې د دوی اوسط په اخیستلو سره د غلطیو څخه مخنیوی وشي لکه څنګه چې موږ ډیری وختونه وایو.

منفي کنټرولونه — NTC او NRT
NTC (د ټیمپلیټ نه کنټرول)، یو کنټرول پرته له ټیمپلیټ څخه ، د دې تصدیق کولو لپاره کارول کیږي چې ایا تجربه لرونکي توکي ککړ شوي دي.عموما، اوبه د نمونې په توګه کارول کیږي.که چیرې د فلوروسینټ عکس العمل شتون ولري، دا په ګوته کوي چې په لابراتوار کې د نیوکلیک اسید ککړتیا رامنځ ته شوې.

دا ککړتیاوې له دې څخه راځي: ناپاک اوبه، ناپاک شوي ریجنټونه چې د Endogenous DNA لري، د پریمر ککړتیا، د لابراتوار تجهیزاتو ککړتیا، د ایروسول ککړتیا او داسې نور، د RNase scavengers او RNase مخنیوی کونکو کارولو ته اړتیا لري.د ایروسول ککړتیا موندل خورا ستونزمن دي.تصور وکړئ چې ستاسو لابراتوار د سموګ په څیر دی، مختلف نیوکلیک اسیدونه په هوا کې معطل شوي.

NRT (No-Reverse Transscriptase),د کنټرول پرته د ریورس ټرانسکریپشن پرته، غیر متقابل لیږد شوی RNA د منفي کنټرول په توګه دی، کوم چې د gDNA پاتې شونو کنټرول دی.

کله چې د جین څرګندونه ترسره کوي، د RNA اندازه د ریورس لیږد وروسته د cDNA مقدار کشف کولو سره کشف کیږي.که چیرې د RNA پاکولو په وخت کې د gDNA پاتې شونو شتون ولري، نو دا به په تجربوي پایلو کې د تېروتنې لامل شي، ځکه چې اصلي پایلې ترلاسه شوي gDNA او cDNA دي.په مجموعي کچه، نه یوازې cDNA، gDNA باید د RNA استخراج په جریان کې په بشپړه توګه لیرې شي.

MIQE (2) — نمونه معلومات
د نومول شوي نمونې معلومات پدې معنی دي چې کله موږ د qPCR په اړه مقاله خپروو، موږ باید د نمونې معلومات په روښانه توګه تشریح کړو، کوم چې د مقالې یوه لازمي برخه ده.په ورته ډول، کله چې موږ نمونې پروسس کوو، موږ باید خپل عملیات هم تنظیم کړو ترڅو د نمونو اعتبار یقیني کړو.

د نمونې تشریح یوازې یوه پایله ده، او موږ باید د ټولې تجربې په جریان کې اخیستل شوي موادو ته ډیره پاملرنه وکړو.

د تجربوي موادو انتخاب
د وینې نمونې - تازه وینه غوره کړئ، له 4 ساعتونو څخه زیات نه.د حجرو نمونې - د قوي ودې په دوره کې د تازه حجرو راټولول غوره کړئ.د څارویو نسج - تازه، په کلکه وده کوونکی نسج غوره کړئ.د نبات نسج - تازه، ځوان نسج غوره کړئ.

تاسو باید یادونه کړې وي چې په دې څو جملو کې کلیدي کلمه شتون لري: تازه.
د پورتنیو نمونو لپاره، په بازار کې تر ټولو ښه، ارزانه، او باثباته کټ د Foregene کټ دی، چې کولی شي په چټکۍ او اسانۍ سره د دوی DNA او RNA استخراج کړي.

د وینې DNA مینی کټ

د Cell Total RNA Isolation Kit

د څارویو ټول RNA جلا کولو کټ

د نبات ټول RNA جلا کولو کټ

د نبات ټول RNA جلا کولو کټ پلس

د نبات د DNA جلا کولو کټ

د تجربوي موادو ذخیره کول
په عمومي توګه، موږ د نمونو ذخیره کولو سپارښتنه نه کوو، که شرایط اجازه ورکړي.په هرصورت، ډیری ملګري شتون لري چې د نمونې اخیستلو وروسته سمدستي تجربې نه شي ترسره کولی، او ځینې حتی د نمونې اخیستلو لپاره ساحې ته د مایع نایتروجن ټانکونو لیږدولو ته اړتیا لري.

د دې ډول سخت کار ملګري لپاره ، زه یوازې دا ویلای شم چې تاسو د ریجنټ مصرفي توکو نه پوهیږئ.اوس ډیری ریجنټ مصرف کونکي شرکتونه ریجنټونه تولیدوي چې کولی شي د خونې په حرارت کې د RNA نمونې ذخیره کړي ، او تاسو کولی شئ د دوی کارولو لپاره غوره کړئ.د ذخیره کولو دودیز میتود د مایع نایتروجن ذخیره کول دي، د مایع نایټروجن ټانک په کارولو سره چې د لیږد لپاره اسانه وي.وروسته له دې چې نمونه بیرته لابراتوار ته راوړو، دا په یخچال کې -80 ° C ذخیره کړئ.

د RNA د تجربو لپاره، د شپږو کلمو اصول باید تعقیب شي:ټیټ حرارت، انزایمونه نشته،اوچټک .

د ټیټ حرارت مفهوم د پوهیدو لپاره اسانه دی؛د انزایمونو پرته، RNase د نړۍ په هر ځای کې شتون لري چې موږ پکې ژوند کوو (که نه نو تاسو به د HIV لخوا وژل شوي وای)، نو څنګه د RNase څخه مخنیوی وشي کله چې تجربې ترسره کیږي یو خورا مهم مفهوم دی؛چټک،په نړۍ کې هیڅ کونګ فو شتون نلري چې مات نشي، یوازې سرعت نشي ماتیدلی.

له همدې امله، په یوه معنی، د استخراج وخت لنډ دی، ښه کټ.ولې کويفارجینکټ په سرعت ټینګار کوي، ځکه چې دوی ښه پوهیږي.

PS: ځینې نجونې په ډیر احتیاط سره تجربه کوي، مګر دوی د څو کلونو کار وروسته د سلیم ډنک په څیر ښه ندي.دوی احساس کوي چې خدای غیر عادلانه دی، د نورو په اړه شکایت کوي، او د ژوند په لټه کې دي.په حقیقت کې، هغه نه پوهیده.هغه د RNA ښه ساتنه نه وه کړې، او د سلیم ډنک لوبغاړی ځیرک و.کله چې هغه تجربه کوله، هغه فکر کاوه چې هغه به د سلیم ډنک په درې ځله، پنځه ځله او دوه ویشلو سره پای ته ورسوي، مګر هغه تجربه ښه کړه.

نوټ: ورو، د RNase یرغل ډیر چانس.څنګه ځان روزلی شی چی ګړندی وی؟هیڅ لاره نشته، یوازې ډیر تمرین وکړئ.

د مختلفو تجربو او مختلفو نمونو لپاره، دا لاهم اړینه ده چې نور ادب ولولئ او د پروسس لپاره مناسب میتود غوره کړئ.د نمونې راټولولو او ذخیره کولو پروسې لپاره، MIQE اړتیا لري چې دا باید په کاغذ کې په واضح ډول لیکل شوي وي، ترڅو بیاکتونکي د کاغذ اعتبار بیاکتنه وکړي، او دا د حیرانتیا ځوانانو لپاره هم اسانه ده چې ستاسو تجربه تکرار کړي.

که څه هم بیولوژیکي تجربې ستونزمنې دي، دوی لوړ پای لري.که تاسو محتاط نه یاست، تاسو کولی شئ نړۍ بدله کړئ.د مثال په توګه، د SARS یو بایو کیمیکل بحران ته وده ورکول، یا د 1.3 ملیارد خلکو د ژغورلو لپاره د هایبرډ وريجو جوړول.لاندې انځور یوه کیمیاوي تجربه ده، تاسو باید پوه شئ چې تاسو د هغه د ډیک په څیر ظاهري لیدلو سره په خپله څیړنه څومره ویاړ یاست.هېر یې کړه، تور یې مه کوه.

MIQE (3) - د نیوکلیک اسید استخراج.
د نیوکلیک اسید استخراج یوه لویه پیښه ده، او د مالیکول بیولوژی ټولې تجربې د نیوکلیک اسید استخراج سره پیل کیږي.تر ټولو لومړی، راځئ چې د نیوکلیک اسید استخراج په اړه د MIQE منځپانګې کاپي کړو.

د دې فورمې په لټه کې، تاسو نشئ کولی په سطحه پاتې شئ.بڼه یوه عقیده ده.د لوړ زده کونکي کیدو لپاره ، تاسو باید وپوښتئ چې ولې.د دې جدول اړین مواد دا دي: تعقیب کړئد RNA پاکوالی، بشپړتیا، ثبات، او استخراج مقدار .

د لومړۍ برخهپروسه یا وسیله د نیوکلیک اسید استخراج مرحله ده.که تاسو د استخراج لپاره اتوماتیک نیوکلیک اسید استخراج کاروئ (پرمختللي، مهرباني وکړئ ما سره د پیرود لپاره اړیکه ونیسئ)، تاسو اړتیا لرئ د وسیلې ماډل نوم په ګوته کړئ.

د کټ نوم او

د بدلون توضیحاتو لپاره کوم کټ کارول شوی ، کوم ځانګړي ریجنټونه اضافه شوي یا کوم ځانګړي عملیات ترسره شوي باید په روښانه ډول تشریح شي ترڅو نور خلک په اسانۍ سره ستاسو تجربه تکرار کړي.

ځینې ​​​​خلک د ځانګړو نمونو د استخراج په وخت کې ځینې ځانګړي ریجنټونه اضافه کوي، فکر کوي چې دا د دوی پټه وسله ده او نورو ته یې مه وایاست.پداسې حال کې چې دا پټ ساتل کیږي، دوی ستاسو د مقالې روښانه کولو فرصت هم له لاسه ورکوي.هوښیار مه کیږه، تاسو باید په ساینسي څیړنو کې د هیواد زاړه جانګ څخه ډیر صادق اوسئ، که تاسو غواړئ هوښیار اوسئ، مقاله به تاسو احمق کړي.

د کټ محصول شمیره باید په یاد ولرئکله چې تاسو کټ امر کړئ او مقاله ولیکئ.په کټ کې عموما دوه شمیرې شتون لري: د بلی - کتلاګ شمیره (د محصول شمیره، د مقالې شمیره)، لوټ - د محصول شمیره (د دې لپاره کارول کیږي چې محصول له کومې ډلې څخه راغلی).

سربیره پردې ، د CAS شمیره ډیری وختونه کارول کیږي کله چې د بایو کیمیکل ریجنټونو امر کول ، او زه به یې یوځای مشهور کړم.د CAS شمیره هغه شمیره ده چې د امریکا کیمیاوي ټولنې لخوا هر نوي کیمیاوي درملو ته ورکول کیږي.عموما، درې شمیرې د ډش په واسطه تړل کیږي.د Rushui د CAS شمیره: 7732-18-5.کیمیاوي ډیری وختونه ډیری عرفونه لري، مګر د CAS شمیره ځانګړې ده.کله چې د درملو امر وکړئ، تاسو کولی شئ لومړی د هغې د CAS شمیره وګورئ.

کور ته نږدې، ولې موږ باید دا شیان په روښانه توګه بیان کړو؟په حقیقت کې، دا د RNA استخراج کیفیت هم چک کول دي.د وسایلو او کټونو کارول به د RNA استخراج ډیر ثابت کړي.د عادي لابراتوارونو استخراج اندازه لویه نه ده، او دا د کټونو سره ترلاسه کیدی شي.

د DNase یا RNase درملنې توضیحات
د فلوروسینټ کمیتي PCR مهمه مسله د DNA ککړتیا مخه نیول دي ، او که چیرې ککړتیا شتون ولري تجربه مه کوئ.له همدې امله، دا اړینه ده چې هغه پروسې بیان کړئ چې تاسو د DNA پروسس کولو لپاره کارولې، ترڅو وښیې چې DNA په تجربوي بهیر کې په بشپړه توګه او په بشپړه توګه لیرې شوی.د سکیمیک ډیاګرام لخوا استازیتوب کیږي.

د RNA او DNA سکیمیک ډیاګرام
په عموم کې، د DNA د لرې کولو طریقه د استخراج وروسته د DNase سره د RNA درملنه ده.په هرصورت، دا نسبتا زاړه میتودونه دي.د تجارتي RNA استخراج کټونه د DNase اضافه کولو پرته د استخراج پروسې په جریان کې د DNA لرې کولو توان لري.د مثال په توګه، د Foregene څخه د کټونو لړۍ.

نوټ: د RNA استخراج په وخت کې د DNA لرې کول یوه ډیره خطرناکه دوه اړخیزه توره ده، کوم چې د RNA استخراج د عملیاتو وخت اوږدوي او د RNA د تخریب خطر زیاتوي.په اصل کې، دا د RNA حاصلاتو او پاکوالي تر منځ د سوداګرۍ بند دی.

برسېره پردې، د سیلیکا پر بنسټ د جذب کولو کالم کې د DNase مقدار ډیر لږ دی، او د لوړ کیفیت DNase باید د تاثیر ترلاسه کولو لپاره وکارول شي.غیر مطلوب DNase نشي کولی په چټکۍ او بشپړ ډول هضم شي.دا د سوداګر د تخنیکي کچې ازموینه ده.البته ، حتی ډیر عجیب سوداګر شتون لري چې ویاړي چې DNA پرته له DNase لرې کیدی شي.دا ویل کیدی شي چې څوک چې دا ویاړ کوي چې DNA په بشپړ ډول د DNase پرته لرې کیدی شي یو غل دی.DNA نسبتا باثباته دوه اړخیز جوړښت دی، او دا یوازې د خبرو کولو او خندا له مینځه وړل کیدی نشي.

د ککړتیا ارزونه
د ارزونې طریقه: د الکتروفوریسس کشف، 1٪ اګروز، 6V/cm، 15 دقیقې، بار کول 1-3 ul

د نیوکلیک اسید مقداري تحلیل
معمولا د UV سپیکٹرو فوټومیټر په کارولو سره اندازه کیږي.اجازه راکړئ لومړی د دریو ارزښتونو OD260، OD280، او OD230 معنی مشهور کړم.
·OD260nm: دا د نیوکلیک اسید د جذب تر ټولو لوړې څوکې د جذب موج دی، او غوره اندازه شوی ارزښت یې له 0.1 څخه تر 1.0 پورې دی.که نه، نمونه کمه کړئ یا متمرکز کړئ ترڅو دا په حد کې راولي.
· OD280nm: دا د پروټین او فینولیک موادو د جذب ترټولو لوړې کچې جذب موج دی.
·OD230nm: دا د کاربوهایډریټ ترټولو لوړ جذب لوړ جذب څپې دی.

بیا، راځئ چې د هر شاخص رول په اړه وغږیږو.د A260 لپاره، دا د نیوکلیک اسید حاصل اندازه کولو لپاره کارول کیدی شي.کله چې OD260=1، dsDNA=50μg/ml، ssDNA=37μg/ml، RNA=40μg/ml.

د پاکوالي لپاره، موږ اړتیا لرو هغه نسبتونه وګورو چې موږ یې عموما ګورو: OD260/280 او OD260/230.
خالص DNA: OD260/280 تقریبا د 1.8 سره مساوي دی.کله چې دا د 1.9 څخه ډیر وي، دا په ګوته کوي چې د RNA ککړتیا شتون لري، او کله چې دا د 1.6 څخه کم وي، دا په ګوته کوي چې د پروټین او فینول ککړتیا شتون لري.
خالص RNA: 1.7
OD260/230: که دا DNA وي یا RNA، د حوالې ارزښت 2.5 دی.کله چې دا د 2.0 څخه کم وي، دا په ګوته کوي چې د شکر، مالګې او عضوي موادو ککړتیا شتون لري.

د RNA بشپړتیا

د RNA بشپړتیا اندازه کول خورا مهم دي.په عموم کې، دا اړینه ده چې د RNA denaturation gel تجربه ترسره کړئ ترڅو وګورئ چې ایا د 28S او 18S RNA ترمنځ روښانتیا دوه اړخیزه اړیکه ده.کله چې دریم بانډ 5S ښکاره شي، دا پدې مانا ده چې RNA په تخریب پیل کړی دی، پرته له invertebrates.

د RNA کیفیت ارزونې لپاره ډاټا: د پورتنیو ازموینو سربیره، د RNA بشپړتیا په برخه کې ځینې نور پرمختللي وسایل ازموینې هم شتون لري، لکه د تجربې اتوماتیک الکتروفورسیس سیسټم RQI بشپړتیا ازموینه، کوم چې کولی شي معلومه کړي چې آیا RNA په ښکاره ډول تخریب شوی.

په ساینسي څیړنو کې، فلوروسینټ کمیتي PCR د هدف جین او داخلي حوالې جین ترمنځ پرتله کول دي.له همدې امله، د RNA نمونې د ساتنې په بهیر کې، د RNA استخراج، او نور، لومړنی هدف د RNA بشپړتیا یقیني کول دي.

د RNA بشپړتیا څنګه د هدف جین او داخلي حوالې جین تر مینځ توازن اغیزه کوي د لاندې شکل څخه په اسانۍ پوهیدلی شي.تخریب به د جین نیمګړتیا لامل شي ، که دا د داخلي حوالې جین نیمګړتیا وي یا د هدف جین نیمګړتیا وي ، دا به په ډیټا خورا لوی تاثیر ولري.

د هدف جین او د حوالې جین سکیمیک ډیاګرام باید ریښتیا نه وي

د مخنیوي ازموینه (ایا د CT ارزښت د لوړ یا ټیټ غلظت یا نورو شرایطو لاندې فشار شوی)

دا ارقام د مثال په توګه په پام کې نیولو سره، د پنځو منحنی Ct ارزښتونه په لاندې ډول دي.د منحنی کریو ترمنځ د CT ارزښتونو ویش نا برابر دی، او د Ct ارزښتونه د لوړ او ټیټ غلظت الندې ځنډول کیږي، کوم چې د PCR مخنیوی قضیه ده.

کلیدي ټکی: د RNA د استخراج په بهیر کې، موږ اړتیا لرو چې غلط مفکورې پریږدو او سمې جوړې کړو.

غلط نظر دا دی: د RNA استخراج یوازې د حاصلاتو تعقیب کوي، فکر کوي چې د ترلاسه شوي RNA اندازه لوی وي، ښه.په حقیقت کې، کله چې موږ اندازه کول کوو، که چیرې د جینونو شمیر خورا لوی نه وي، موږ ډیر RNA ته اړتیا نلرو.د RNA اندازه چې تاسو یې استخراج کوئ د کافي څخه ډیر دی.

صحیح مفهوم دا دی:د RNA استخراج باید پاکوالی، بشپړتیا او ثبات تعقیب کړي.پاکوالی کولی شي ډاډ ترلاسه کړي چې راتلونکی ریورس لیږد نه منع کیږي او ډاټا به د DNA لخوا اغیزمن نشي.بشپړتیا د هدف ترتیبونو او داخلي حوالو توازن تضمینوي.ثبات د ثابت نمونې بار کول ډاډمن کوي.

MIQE (4) - ریورس لیږد
غلط فهم: د لوړې نمونې حجم تعقیب.
سمه مفهوم: ثبات (ثبات) تعقیب کړئ، پرته له دې چې د RNA بار شوي مقدار ته په پام سره، د ریورس لیږد موثریت ثابت پاتې شي، دا ډاډ ترلاسه کوي چې په cDNA کې توپیر کولی شي په ریښتیا سره په mRNA کې توپیر منعکس کړي.
موږ دا پروسه د سکیمیک ډیاګرام سره تشریح کوو:

د ریورس لیږد موثریت سکیمیک ډیاګرام، ریښتیا مه کوئ
له هرڅه دمخه ، موږ اړتیا لرو د ریورس لیږد پروسې او PCR پروسې ترمینځ توپیر پوه شو.PCR د تودوخې او انیل کولو ډیری پروسې څخه تیریږي، او د هدف ټوټه په چټکۍ سره وده کوي؛په داسې حال کې چې ریورس لیږد دا پروسه نه لري، موږ تصور کولی شو چې د نقل کولو پروسې په جریان کې، د RNA ډیری ټوټې په حقیقت کې یو له بل سره تړاو لري.

لکه څنګه چې شتون لري د cDNA معلوماتو ډیری ټوټې ترلاسه کولی شي، دا باید تر اوسه پوه شي، ځکه چې لویې او کوچنۍ ټوټې بیرته لیږدول شوي، او دا ناشونې ده چې په یوه ټوټه تمرکز وشي.او ځکه چې د RNA اندازه نسبتا کوچنۍ ده، د ترلاسه شوي cDNA اندازه هم نسبتا کوچنۍ ده، د PCR برعکس، کوم چې د پراخولو اغیز لري، نو په بنسټیز ډول یې کشف کول ناممکن دي.

د cDNA الیکٹروفورسس پایلې
دوهم، په مثالي توګه، ریورس لیږد یو له بل سره ترسره کیږي، مګر د هیڅ شرکت څخه هیڅ ریورس ټرانسکریټ نشي کولی دا اغیزه ترلاسه کړي.اساسا ، د ډیری ریورس لیږدونې موثریت د 30-50٪ ترمینځ ودریږي.که دا قضیه وي، نو موږ به د دې پرځای یو نسبتا باثباته ریورس لیږد موثریت ولرو، کوم چې موږ غواړو په انځور کې وګورو: 3 RNAs 2 cDNAs ترلاسه کوي، 6 RNAs 4 cDNAs ترلاسه کوي، نو مهمه نده چې څومره نمونه بار شوي وي، د ریورس لیږد موثریت نسبتا مستحکم دی.موږ نه غواړو هغه وضعیت وګورو چیرې چې د برعکس لیږد موثریت بې ثباته وي او لوړ غلظت منع شوی وي.

نو، څنګه تایید کړئ چې ایا د ریورس لیږد موثریت مستحکم دی؟طریقه ډیره ساده ده، تاسو یوازې د پرتله کولو ازموینې ته اړتیا لرئ: یو دا دی چې د RNA دوه چنده کولو وروسته په cDNA کې نقل کړئ، او بل دا چې په cDNA کې د بیرته راګرځیدو وروسته دوه چنده کمول رامینځته کړئ، او بیا qPCR وکړئ ترڅو ترلاسه شوي سلپ وګورئ چې دا مطابقت لري.د لوړ زده کونکي په توګه، تاسو باید په ثانیو کې پوه شئ.لکه څنګه چې لاندې ښودل شوي:

د RNA او cDNA کمول ترڅو ازموینه وکړي چې ایا د ریورس لیږد موثریت مستحکم دی
د ټرانسکریپټیس او کټ ریورس کړئ
څنګه کولی شي کامل فلوروسینټ کمیتي PCR عالي ریورس ټرانسکریټیس او کټ ولري.ریورس ټرانسکریپټیس تقریبا د سرچینې له مخې په دوه ډوله ویشل شوی، AMV یاM-MLV، او د دوی فعالیت ورته دی لکه څنګه چې په جدول کې ښودل شوی.

د RNase H فعالیت
RNase H د Ribonuclease H دی، چینایي نوم ribonuclease H دی، کوم چې یو انډوریبونیوکلیز دی چې کولی شي په ځانګړي ډول د DNA-RNA هایبرډ سلسله کې RNA هایدرولیس کړي.RNase H نشي کولی د فاسفوډیسټر بانډونه په واحد یا ډبل سټنډ شوي DNA یا RNA کې هایدرولیس کړي ، یعني دا نشي کولی واحد ډنډ یا دوه اړخیز DNA یا RNA هضم کړي.په عموم ډول د cDNA دوهم سټینډ ترکیب کې کارول کیږي.

عجیبه خبره ده.موږ وایو چې ریورس ټرانسکریپټیس د RNase H فعالیت لري، نه دا چې ریورس ټرانسکریټیس RNase H لري، او دا ممکن نه وي چې RNase H له ریورس ټرانسکریټیس څخه جلا کړي، شاید د دې لپاره چې په ریورس ټرانسکریپټیس کې د ځینو ګروپونو د جوړښت له امله دا فعالیت د ریورس ټرانسکریپټیس له امله رامنځته شي.

له همدې امله، پرته له دې چې د AMV لوړ ریورس لیږد موثریت، د دې RNase H فعالیت د cDNA حاصل کموي.البته، د ریجنټ جوړونکي په دوامداره توګه خپل محصولات غوره کوي ترڅو د RNase H فعالیت په ریورس ټرانسکریپټیس کې له مینځه یوسي څومره چې امکان ولري د cDNA حاصل ډیر کړي.
د annealing حرارت

په مختلفو تودوخې کې د RNA ثانوي جوړښت
په مختلفو تودوخې کې د RNA ثانوي جوړښت لپاره پورته انځور وګورئ، او د mFold آنلاین وسیله وکاروئ ترڅو د ځانګړي تودوخې او مالګې غلظت شرایطو لاندې د هدف ټوټې ثانوي جوړښت مشخص کړي.په 55°C کې، د RNA ثانوي جوړښت لاهم خورا پیچلی دی، ریورس ټرانسکریټ کار نشي کولی، او ثانوي جوړښت تر 65 درجو پورې په بشپړه توګه حل نشي، پداسې حال کې چې د AMV او M-MLV مطلوب تودوخه د دې تودوخې څخه خورا ټیټه ده.
چې څه کول پکار دي؟ثانوي جوړښت پخپله د ټیمپلیټ بشپړونکي جوړه ده، کوم چې د پریمر او ریورس ټرانسکریټس او ټیمپلیټ ترمنځ د قوي سیالۍ لامل کیږي، په پایله کې د یو لړ ستونزو لکه د ټیټ E او ضعیف تکرار وړتیا.

چې څه کول پکار دي؟یوازې د امکان تر حده د انیل کولو تودوخې لوړ کړئ.

ډیری ریجنټ جوړونکي د جینیاتي انجینرۍ له لارې خپل ریورس ټرانسکریټیس ښه کوي.ځینې ​​یې د عکس العمل تودوخه لوړوي لکه جیفان او ایډیلای، او ځینې یې د RNase H انزایم فعاله ډله لرې کوي ترڅو د انزایم او RNA ټیمپلیټ ترمنځ اړیکه ښه کړي.لوړ تړاو کولی شي په رقابتي توګه ثانوي جوړښت راوباسي او په اسانۍ سره لوستل شي، او د ریورس لیږد موثریت هم خورا ښه کړي.
کلیدي ټکی: د ریورس ټرانسکریپشن د تکراري لیږد موثریت د دوام لپاره خورا مهم دی (انزایمونه باید نه یوازې اغیزمن وي بلکه باثباته وي)، د نمونې د اندازې په پرتله، که چیرې دا په ځانګړې توګه د لوی پیمانه فلوروسینټ کمیتي PCR نه وي، نو دا به ممکنه نه وي.ډیری cDNAs.
مختلف تولید کونکو هم د دوام په لټه کې ځینې هڅې کړې دي.د مثال په توګه، ډیری شرکتونو اوس د پلور لپاره د معیاري کټ په توګه ریورس لیږد بسته کړی، کوم چې یو ښه انتخاب دی.
د مثال په توګه، د Foregene RT اسانه لړۍ کټونه:

RT Easy I (د لومړي سټینډ cDNA ترکیب کټ لپاره ماسټر پریمکس)

MIQE (5) - د هدف جین معلومات

پورته ارقام تشریح کوي
1. آیا دا جین د تکراري تجربو لپاره اغیزمن دی په عمومي ډول د تکرار تجربو لخوا تایید کیدی شي.
2. د جین ID، تاسو پوهیږئ.
3. د جین اوږدوالی، د هدف جین ټول اوږدوالی یقینا کومه ستونزه نده.کله چې د پرائمر ډیزاین کول، ډاډ ترلاسه کړئ چې د امپلیکون اوږدوالی د 80-200bp ترمنځ دی ترڅو د ښه امپلیفیکیشن موثریت یقیني کړي.
4. د سیکوینس بلاسټ پرتله کولو معلومات، هدف جین باید په جینبینک کې پرتله شي ترڅو د غیر مشخص پراخوالي مخه ونیسي.
5. د pseudogenes شتون.سیوډوجین د DNA ترتیب دی چې یو نورمال جین ته ورته دی مګر خپل نورمال فعالیت له لاسه ورکوي.دا اکثرا د یوکریټس په څو جین کورنۍ کې شتون لري.دا معمولا د ψ لخوا نمایش کیږي.دا په جینوم کې غیر فعال جینومیک DNA کاپي ده چې د کوډ کولو جین ترتیب سره ورته وي.، په عمومي ډول نه نقل شوي ، او هیڅ روښانه فزیولوژیکي معنی نلري.
6. د پرائمر موقعیت د Exons او introns په پرتله.په لومړیو کلونو کې، کله چې موږ د DNA ککړتیا ستونزه حل کړه، موږ ډیری وختونه د پرائمرونو، exons، او انټرونونو موقعیتونو ته پام کاوه، او په عمومي توګه د انټرونونو په اوږدو کې د پرائمرونو ډیزاین کول په پام کې نیول شوي ترڅو د DNA امپلیفیکیشن څخه مخنیوی وشي.مهرباني وکړئ لاندې شکل وګورئ: تور د انټرون نمایندګي کوي، مختلف بلیوز د خارجونو استازیتوب کوي، ګلابي د عام پریمرونو استازیتوب کوي، او روښانه سور د انټرون-سپاننګ پریمر استازیتوب کوي.

سکیماتیک، هیڅکله ریښتیا نه
دا کوم بشپړ پلان ښکاري ، مګر په حقیقت کې ، په ډیری قضیو کې ، د ټرانس انټرون پرائمرونه هغومره جادویی ندي لکه څنګه چې تصور کیږي ، او دا به د غیر مشخص پراخوالي لامل هم شي.نو د DNA د ککړتیا د مخنیوي غوره لاره د DNA په بشپړه توګه لرې کول دي.
7. د جوړښت وړاندوینه.د دې مثال په کارولو سره بیا د mFold آنلاین وسیله وکاروئ ترڅو په ځانګړي تودوخې او د مالګې غلظت کې د هدف ټوټې ثانوي جوړښت مشخص کړئ.

په مختلفو تودوخې کې د RNA ثانوي جوړښت
ثانوي جوړښت پخپله د ټیمپلیټ بشپړونکي جوړه ده، کوم چې به د پریمر او ټیمپلیټ جوړونې ترمنځ قوي سیالۍ رامینځته کړي، او د پریمر پابندۍ چانس کم وي، چې په پایله کې د یو لړ ستونزو لکه E ټیټه او ضعیف تکرار وړتیا رامنځته کیږي.د سافټویر وړاندوینې له لارې، که چیرې د ثانوي جوړښت ستونزه شتون ونلري، دا به خورا ښه وي.که شتون ولري، زموږ تعقیب مقاله به په ځانګړې توګه د دې ستونزې حل کولو څرنګوالي په اړه بحث وکړي.

MIQE (6)—qPCR اولیګونیوکلیوټایډز

د فلوروسینټ کمیتي PCR لپاره ، لومړی شی چې تاسو هره ورځ ورسره مبارزه کوئ د RNA استخراج دی ، او دوهم شی ممکن د پریمر ډیزاین وي.
له هرڅه دمخه ، موږ لاهم د MIQE چک لیست سره سم د پریمر ډیزاین په اړه مقررات ګورو.دا دومره ساده ده چې سپکاوی کولی شي خندا وکړي، او موږ کولی شو دا په یوه جمله کې پای ته ورسوو: د پریمر تحقیقاتو ترتیب او موقعیت او د ترمیم طریقه ومومئ.د پریمر پاکولو میتود لپاره، د پریمر ترکیب اوس مهال خورا ارزانه دی، qPCR د PAGE او پورته پاکولو میتودونو وړ دی، او د ترکیب وسیله معلومات مهم ندي.ډیری خلک د لسیزو راهیسې پریمر کوي او نه پوهیږي چې ترکیب ABI3900 دی.
د پرائمر ډیزاین اصولو ته په پام سره، تاسو اړتیا نلرئ دا د روټ په واسطه یاد کړئ، ځکه چې ډیری پرائمر ډیزاین سافټویر یا آنلاین وسیلې کولی شي دا ستونزې حل کړي (سپارښتنه شوې آنلاین وسیله primer3.ut.ee/)، او د پریمر ډیزاین 99.999٪ په لاسي ډول نه ترسره کیږي وګورئ، لیکوال ځینې وختونه په ورځ کې سلګونه پرائمرونه ډیزاین کوي، که تاسو یې یو له بل سره ولولئ، نو تاسو به یې یو کراس شي.
د پریمرونو ډیزاین کولو وروسته یوازې لاندې ټکي وګورئ:
1. ډیزاین پریمرونه 3′ پای ته نږدې وي: د cDNA د لومړي سټینډ ترکیب لپاره د oligo dT پرائمر کارولو په حالت کې ، د برعکس لیږد موثریت او RNA بشپړتیا په پام کې نیولو سره ، ډیزاین شوي پرائمرونه باید د 3′ پای ته نږدې ډیزاین شي ترڅو د امپلیفیکیشن موثریت ښه کړي.د لاندې تشریح کولو لپاره یو عکس وکاروئ (د دې پوهیدو لپاره هیڅ لاره نشته):

ولې پریمر باید د 3′ پای ته نږدې ډیزاین شي، دا باید ریښتیا نه وي
2. د TM ارزښت: د Tm ارزښت په 55-65°C کې دی (ځکه چې د Exonuclease فعالیت په 60°C کې ترټولو لوړ دی) او د GC مینځپانګه 40%-60% ده.
3. BLAST: د دې لپاره چې د جینوم غیر مشخص پراخوالي څخه مخنیوی وشي، بلاسټ باید د اضافي تایید لپاره وکارول شي.

MIQE(7)—qPCR پروسه

1. د qPCR کټ
د MIQE اړتیاو سره سم ، موږ باید په مقاله کې د عکس العمل بشپړ شرایط په روښانه ډول تشریح کړو ، پشمول د PCR عکس العمل سیسټم تنظیم کول ، کوم کټ کارول کیږي ، جوړونکی څوک دی ، د عکس العمل سیسټم څومره لوی دی ، ایا د رنګ کولو میتود یا د تحقیقاتو میتود کارول کیږي ، د PCR برنامې تنظیمات.وترنرۍ چلوونکي به خامخا ومومي چې تر هغه چې کټ غوره شوی وي، پورته معلومات اساسا ټاکل کیږي.
په اوس وخت کې، د فلوروسینټ کمیتي PCR کټونو تولید او تولید خورا بالغ ټیکنالوژي ده.تر هغه چې تاسو خورا خراب جوړونکي غوره نه کړئ، د ستونزو احتمال لوړ نه دی، مګر موږ بیا هم غواړو تاسو سره یو څو ټکي شریک کړو:
د هوټ سټارټ ټیک انزایم:د PCR ترټولو مهمه برخه د هاټ سټارټ ټیک انزایم دی.په بازار کې د هاټ سټارټ انزایمونه عموما په دوه ډوله ویشل شوي ، یو یې په کیمیاوي ډول بدل شوی د هاټ سټارټ انزایم دی (تاسو کولی شئ دا د پارافین سرایت په توګه تصور کړئ) ، او بل یې د انټي باډي ترمیم لپاره د ګرم پیل انزایم دی (د انټيجن - انټي باډي پابند).کیمیاوي تعدیل د ګرم پیل شوي انزایمونو لومړنۍ لاره ده.کله چې یو ټاکلی حرارت ته ورسیږي، انزایم به خپل فعالیت خوشې کړي.د انټي باډي ترمیم شوي هاټ سټارټ انزایم د انزایم فعالیت بندولو لپاره بیولوژیکي میتودونه کاروي.کله چې یو ټاکلی تودوخې ته ورسیږي، انټي باډي به د پروټین په توګه غیر فعال او غیر فعال شي، او د انزایم فعالیت به په عمل کې راوستل شي.

په هرصورت، دا څه ګټه لري؟دا په داسې حال کې ده چې د انټي باډي تعدیل شوي انزایمونو خوشې کولو فعالیت د کیمیاوي تعدیل شوي انزایمونو په پرتله ګړندی دی ، نو د حساسیت له مخې ، د انټي باډي ترمیم شوي انزایمونه لږ ګټه لري ، نو په بازار کې په کټونو کې اساسا هیڅ کیمیاوي تعدیل شوي انزایمونه شتون نلري.که شتون ولري، نو د دې جوړونکي ټیکنالوژي لاهم د زریزې په دوره کې بنده ده.
د مګنیزیم ایون غلظت:د میګنیشیم آئن غلظت د PCR عکس العمل کې خورا مهم دی.مناسب مګنیزیم آئن غلظت کولی شي د تاق انزایم فعالیت خوشې کړي.که چیرې غلظت خورا ټیټ وي ، د انزایم فعالیت به د پام وړ کم شي؛که چیرې غلظت خورا لوړ وي ، نو د انزایم کټالیز غیر مشخص لوړوالی به وده ومومي.د مګنیزیم ایون غلظت به د پریمرونو په انیل کولو ، د ټیمپلیټ د خولۍ تودوخې او د PCR محصولاتو باندې هم اغیزه وکړي ، پدې توګه د پراخ شوي ټوټو حاصل باندې اغیزه کوي.د مګنیزیم آئن غلظت عموما په 25mM کې کنټرول کیږي.البته، د ښه کټ لپاره، د مګنیزیم آئن غلظت باید ښه کنټرول شي.ځینې ​​​​سوداګر په ریجنټ کې د میګنیشیم آئن چیلیټینګ اجنټ اضافه کوي ، کوم چې کولی شي د مګنیزیم آئن غلظت د اتوماتیک تنظیم کولو اغیز ترلاسه کړي.
د فلوروسینټ رنګ غلظت:فلوروسینټ رنګ چې د SYBR شنه رنګ دی چې موږ یې معمولا کاروو، په عمده توګه د ډبل سټنډ شوي DNA کوچني نالی سره په تړلو سره فلوروسینس تولیدوي، ځکه چې د ډبل سټنډ شوي DNA سره د رنګ تړل غیر مشخص دی، دا د دې لپاره چې ووایو تر هغه چې دوه اړخیزه DNA وي، دا د ډی این اے سره یو ځای کیږي او د تودوخې سره یوځای کیږي. سیسټم به د دې سره یوځای شي ترڅو د شالید سیګنال رامینځته کړي.
PS: د دې د ر lightا حساس ملکیتونو له امله ، په بازار کې محصولات عموما په نسواري مبهم سنټرفیوج ټیوبونو کې بسته شوي وي (لکه څنګه چې لاندې عکس کې ښودل شوي).په هرصورت، دا به د یوې ستونزې سره مخ شي.دا ستونزمنه ده چې وګورئ چې ایا د نمونې اخیستلو په وخت کې مایع څښل کیږي.پدې برخه کې ، کینګکی واقعیا ترټولو کارونکي دوستانه دی (لکه څنګه چې لاندې عکس کې ښودل شوي) ، او شفاف ټیوب په ناپاک ټین کڅوړه کې بسته شوی.بیا یې د ټین کڅوړه کې واچوئ، د رڼا او نمونې څخه د مخنیوي اسانتیا په پام کې نیولو سره.تاسو باید د محصول صحیح شمیره غوره کړئ.TSE204 یو ډیر لګښت لرونکی وجود دی، کوم چې زه غواړم واښه کښت کړم.

د فلوروسینټ رنګ غلظت هم خورا مهم دی.که چیرې غلظت ډیر ټیټ وي، د امپلیفیکیشن وکر به په وروستي مرحله کې پورته نشي او بشپړ نه وي؛که غلظت ډیر لوړ وي، نو دا به د شور مداخلې لامل شي.څرنګه چې د فلوروسینټ کمیت PCR په عمده توګه د CT ارزښت پورې اړه لري، که چیرې د فلوروسینټ رنګ غلظت په سمه توګه تنظیم نه شي، ټیټ ټکی د لوړې نقطې څخه غوره دی.البته، د رنګ مناسب غلظت غوره دی.

ROX: د ROX رنګونه د ښه او ښه فلوروسینس سیګنال غلطیو د سمولو لپاره کارول کیږي.ځینې ​​وسیلې جوړونکي انشانکن ته اړتیا لري، پداسې حال کې چې نور یې نه کوي.د مثال په توګه، د Thermo Fisher Scientific د ریښتیني وخت PCR امپلیفیکیشن وسیلې کارول معمولا کیلیبریشن ته اړتیا لري ، پشمول 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, او داسې نور. د عمومي کټ لارښوونې به دا تشریح کړي.
د Foregene qPCR مکس د ROX رنګ هم لري، کوم چې په مختلفو ماډلونو کې د کارولو لپاره مناسب دی.

د ریښتیني وخت PCR کټ-تقمان

د ضعیف هایدروجن بانډ درملنه: د کمزورو هایدروجن بانډونو درملنه نسبتا تخنیکي مسله ده.د ډیرو کټونو لارښود هیڅ شی نه دی لوستلی، مګر هیڅ یو یې د دې موضوع یادونه نه ده کړې.په حقیقت کې، دا خورا مهم دی.د اډو ترکیب په عمده توګه د هایدروجن بانډونو په ځواک پورې اړه لري.قوي هایدروجن بانډونه نورمال امپلیفیکیشن دي ، او ضعیف هایدروجن بانډونه د غیر مشخص لوړیدو لامل کیږي.که ضعیف هایدروجن بانډونه په ښه توګه له مینځه یوړل نشي، د غیر مشخص پراخوالي مخنیوی نشي کیدی.د لیکوال په ساحه کې، یوازې یو څو شرکتونو دا ستونزه لیدلې ده.کله چې تاسو کټ وپیرئ ، تاسو کولی شئ مراجعه وکړئ چې ایا تاسو پدې برخه کې د هغه کټ لپاره حل په پام کې نیولی چې تاسو یې غوره کول غواړئ.

د عکس العمل حجم: د 20-50ul سیسټم ډیر عام کارول کیږي، او کوچني حجمونه احتمال لري چې د غلطیو لامل شي.په عموم کې ، د کټ لارښوونې به د PCR عکس العمل حجمونو کارولو وړاندیز وکړي.هوښیار مه اوسئ او د لګښتونو خوندي کولو لپاره کوچني حجمونه وکاروئ.هدف.د سوداګرو لخوا وړاندیز شوی حجم واقعیا ازمول شوی ، او دا ممکن وي چې دوی نشي کولی د وړو حجمونو له امله رامینځته شوي غلطیو ستونزه حل کړي.
2. د ټیوب پلیټ جوړونکي او مادې شمیره
هرڅوک د فلوروسینټ کمیتي PCR اصول پیژني.د فلوروسینس راټولول په عمده توګه د PCR ټیوب کیپونو له لارې ترسره کیږي.کله چې د PCR مصرفي توکي غوره کړئ، دوه ټکو ته پام وکړئ: ښه رڼا لیږد او د وسیلې لپاره مناسب.په عموم کې ، د اصلي برانډونو بورډونه او ټیوبونه ښه دي ، مګر تاسو باید د موافقت شرایطو کې په دقت سره غوره کړئ ، که نه نو تاسو به نشئ کولی وسیله وکاروئ.

4. د لوړې کچې پوهه

MIQE (8)—qPCR تایید
دا د qPCR لوړ لومړیتوب دی!دلته ډیری اتلان په شګو کې راوتلي دي.البته، دا هم امکان لري چې تاسو نېکمرغه یاست او هغه جینونه چې تاسو یې مطالعه کړي ساده دي، نو تاسو د باد په اوږدو کې د یخ غار له لارې تیر شوي.د qPCR د تایید معلوماتو هدف د معلوماتو اعتبار ازموینه ده.موږ اړین تایید شوي معلومات په لاندې ډول لیست کوو:

1.Specificity ازموینه
د هدف جین امپلیفیکیشن ځانګړتیا د دې چک کولو له لارې ازمول کیږي چې ایا د الیکٹروفورسیس عکس یو واحد بانډ دی؛د ترتیب تصدیق؛د خټکي منحنی څرنګوالی د لیدلو لپاره چې آیا د چوک نقشه واحد ده؛د انزایم هضم تصدیق او نور میتودونه.
دلته، موږ په t تمرکز کووهغه د خټکي منحني میتود په کارولو سره د غیر مشخص لوړولو تحلیل.په عموم ډول، کله چې موږ پرائمر ډیزاین کوو، د محصول د ټوټې اندازه باید د 80-200bp په حد کې وي، کوم چې د PCR محصول د 80-85 ° C سلسله د تودوخې درجه جوړوي.له همدې امله، که چیرې متفرقه څوکې شتون ولري، نو باید نور غیر مشخص پراخیدونکي محصولات شتون ولري؛که چیرې لوړوالی د 80 درجې سانتي ګراد څخه ښکته ښکاري، دا په عمومي توګه د پریمر ډیمر په توګه ګڼل کیږي.که چیرې لوړوالی د 85 درجې سانتي ګراد څخه پورته څرګند شي، دا په عمومي ډول د DNA ککړتیا یا د لویو ټوټو غیر مشخص پراخوالی ګڼل کیږي.
یادونه: ځینې وختونه یوازې د 80 درجې سانتي ګراد یو واحد لوړوالی شتون لري.په دې وخت کې، دا مفهوم باید تعقیب شي.دا احتمال لري چې د امپلیفیکیشن پایلې ټول پریمر ډیمرونه وي.

د خټکي نورمال وکر (یوازینۍ چوکۍ پرته له کوم ځانګړي پراخوالی)

د خټکی ستونزه لرونکی وکر (د جعل چوٹی غیر مشخص پراخوالی)
【د قضیې تحلیل】

اصلي چوکۍ شتون لري، مګر د پریمر ډیمر جدي دی
په لاندې شکل کې د واحد لوړ خټکي وکر کولی شي په اسانۍ سره ستاسو سترګې فریب کړي، فکر وکړئ چې دا یوه بشپړه تجربه ده، مګر پایله یې په بشپړه توګه غلطه ده.پدې وخت کې، موږ باید د خټکي تودوخې ته وګورو.د لوړ تودوخې درجه د 80 درجو څخه ښکته ده، کوم چې په بشپړ ډول پریمر ډیمر دی.

هیڅ نښه نده، ټول پریمر ډیمرونه
دلته، زما ورور نشي کولی ودروي.لاندې عکس د ګرځنده تلیفون سره اخیستل شوی عکس دی چې ما ته د یو غل لخوا لیږل شوی.هغه ریجنټونه چې هغه یې کارولي په صنعت کې ټول عام کارول شوي برانډونه دي.هغه د یو T-prefix برانډ څخه بل T-prefix برانډ ته بدل شو.زه فکر کوم چې تاسو دمخه دا اټکل کړی دی.بدمعاش ماته چیغې کړه: "په لومړي عکس کې کارول شوی ریجنټ خورا ښه دی ، او چوکۍ واحد دی.وروسته، د ریجنټ کارولو وروسته چې تاسو یې وړاندیز کړی، دا د دویم انځور په څیر کیږي، د مخلوط چوټیو سره.تاسو ما بدبخته کړی دی."
دوه ګرافونه جلا کړئ.په لومړي نظر کې، یو یې یو واحد چوکۍ لري، او بل یې دوه ګونی چوکۍ لري.بې معنی، یو واحد چوک یقینا ښه دی.ایا دا ریښتیا ده؟
د Dou E څخه بدتر دی، که زه دوه عکسونه په لاندې انځور کې واچوم، تاسو به سمدلاسه پوه شئ.په حقیقت کې، موږ په اسانۍ سره د دې ډول انځور لخوا فلج شوي یو.د دقیق تحلیل وروسته، موږ وموندله چې: د لومړي ارقام لوړوالی په 75 ° C کې دی، کوم چې په بشپړ ډول پریمر ډیمر دی؛د دویمې شمیرې لوړوالی په 75 ° C او 82 ° C کې ښکاري، لږ تر لږه هلته محصول ښکاري.

د زده کونکو لخوا د عکس العمل عکسونه
نو بنسټیزه ستونزه د ریجنټ ستونزه نه ده، مګر د پریمر ډیزاین ستونزه ده.په ورته وخت کې ، دا هم ثابتوي چې ځینې لوی برانډونه د اوسپنې کیفیت نلري ، او دا هم ثابتوي هغه څه چې زما ورور مخکې وویل: دا د ریجنټ برانډ ندی چې ستاسو مقالې ملاتړ کوي.دا ستاسو مقاله ده چې د ریجنټونو نښه یې رامینځته کړې.یوازې تصور وکړئ، که چیرې بدکار ریجنټ بدل نه کړي، غلط معلومات به ژورنال ته واستول شي، او څه به پیښ شي یوه تراژیدي به وي.
2. د خالي کنټرول Ct ارزښت
تشریح مه کوئ، که خالي کنټرول د Ct ارزښت ولري، ایا دا ککړتیا نه ده؟په هرصورت، تاسو لاهم اړتیا لرئ پوه شئ چې کوم خالي کنټرول د Ct ارزښت لري.که دا NTC وي، دا پدې مانا ده چې بهرنۍ DNA شتون لري لکه د ریجنټ ککړتیا.که دا NRT وي، دا پدې مانا ده چې استخراج شوي RNA د DNA ککړتیا لري.
3. معیاري وکر
د سلیپ او محاسبې فورمول په شمول، د PCR موثریت د فارمول له لارې محاسبه کیدی شي.یوه بشپړه تجربه د معیاري منحني سلپ ته اړتیا لري ترڅو 3.32 ته نږدې شي، او R² 0.9999 ته نږدې شي.
4. خطي متحرک سلسله
د عکس العمل متحرک سلسله خطي ده.د معیاري وکر د تولید لپاره کارول شوي ټیمپلیټ له مخې، متحرک سلسله باید لږترلږه 5 غلظت تدریجي شامل وي، او د لوړ غلظت تدریجي او ټیټ غلظت ګریډینټ کې د Ct ارزښتونو بدلون ته پاملرنه وکړئ.
5. د کشف دقت
د qPCR په پایلو کې بدلونونه، دا د تکرار ضعیف وړتیا، یعني ضعیف دقیقیت، د ډیری فکتورونو له امله رامینځته کیږي، په شمول د تودوخې، تمرکز، او عملیات.د qPCR دقیقیت عموما د کنټرول وړ کم کیږي ځکه چې د کاپي شمیر کمیږي.په مثالي توګه د تجربوي تغیراتو دننه، دا تخنیکي توپیر باید د بیولوژیکي تغیر څخه توپیر ولري، او بیولوژیکي نقلونه کولی شي په مستقیم ډول د ګروپونو یا درملنې ترمنځ د QPCR پایلو کې احصایوي توپیرونه په نښه کړي.په ځانګړې توګه د تشخیصي ارزونو لپاره، د سایټونو او آپریټرونو په اوږدو کې د تر ټولو غوره انټراساس دقیقیت (تکرار وړتیا) باید راپور شي.
6. د کشف موثریت او LOD (په ملټي پلیکس qPCR کې)
LOD د 95٪ مثبتو نمونو ترټولو ټیټ غلظت دی چې کشف شوي.په بل عبارت، د LOD غلظت چې د هدف جین نقلونو په سیټ کې شتون لري باید د ناکام عکس العملونو 5٪ څخه ډیر نه وي.کله چې د ملټي پلیکس qPCR تحلیل ترسره کوي، په ځانګړې توګه د نقطو بدلونونو یا پولیمورفیزمونو په یو وخت کې د کشف لپاره، ملټي پلیکس qPCR باید داسې شواهد وړاندې کړي چې په ورته ټیوب کې د څو هدفونو ټوټو دقت سره موافقت نه کیږي، د څو کشف او واحد ټیوب کشف موثریت او LOD باید ورته وي.په ځانګړي توګه کله چې د لوړ غلظت هدف جینونه او د ټیټ غلظت هدف جینونه په ورته وخت کې پراخه کیږي ، دې ستونزې ته باید پاملرنه وشي.
ستونزې او حل لارېپه عمومي توګه، هغه ستونزې چې ډیری وختونه د qPCR ډیبګ کولو کې ورسره مخ کیږي په لاندې اړخونو تمرکز کوي:
غیر مشخص پراخوالی
· د پریمر غلظت ستونزمن انتخاب او د پریمر ډیمر سره ستونزه
· د انیل کولو تودوخه ناسمه ده
ثانوي جوړښت د امپلیفیکیشن موثریت اغیزه کوي
غیر مشخص پراخوالی
غیر مشخص پراخوالیواقع کیږي، دا عموما په پام کې نیول کیږي چې آیا د پریمر ډیزاین مناسب نه دی، مګر که تاسو د پریمر بدلولو لپاره بیړنۍ نه یاست، تاسو کولی شئ لومړی لاندې طریقې هڅه وکړئ (اصول هم ضمیمه دی):
· د انیل کولو تودوخې زیاتوالی - هڅه وکړئ چې ضعیف هایدروجن بانډونه د ساتلو توان ونلري؛
د انیل کولو او اوږدیدو وخت لنډ کړئ - د ضعیف هایدروجن بانډونو چانس کم کړئ؛
· د پریمر غلظت کم کړئ - د بې ځایه پریمرونو او غیر هدف لرونکي سیمو د پابندۍ چانس کم کړئ؛
د ټیټ لوړولو موثریت
د غیر مشخص امپلیفیکیشن سره مخالف حالت - د ټيټ امپلیفیکیشن موثریت ، او د ټيټ امپلیفیکیشن موثریت سره د معاملې لپاره اقدامات یوازې برعکس دي:
د انیل کولو او اوږدیدو وخت اوږدول؛
درې مرحلې PCR ته بدل کړئ او د انیل کولو تودوخې کم کړئ؛
د پریمر غلظت زیاتول؛
Ps: ډیری فارغ شوي زده کونکي چې په 90s کې زیږیدلي د تجربې د ډیبګ کولو څرنګوالي زده کړه نه غواړي ، او امید لري چې کټ کولی شي ستونزه په بشپړ ډول حل کړي (که تاسو غواړئ د فراغت وروسته د څیړنې او پراختیا لپاره د ریجینټ شرکت ته لاړ شئ) ، په حقیقت کې ، د ریجنټ جوړونکي هم دا ډول فکر کوي ، زه امید لرم چې دا د احمق په توګه کارول کیدی شي کله چې تاسو یې ترلاسه کړئ نو د تولید کونکي ستونزې په شمول د ډیری غیرمعمولي ستونزو حل کولو لپاره. د کمزوري H-بانډ جذب فکتورونو معرفي کول.د ستونزې په اسانۍ سره حل کولو لپاره، احمقان لاهم باید د ریجنټ شرکت پیژندنه ولولي ترڅو وګوري چې ایا کوم فاکتور شتون لري چې ضعیف هایدروجن بانډونه جذبوي.
د پریمر غلظت ستونزمن انتخاب او د پریمر ډیمرونو سره ستونزه
طریقه 1: په عمومي ډول ووایو، د qPCR لپاره د کټ لارښوونې وړاندیز شوي سیسټمونه او وړاندیز شوي پریمر غلظت لري.
طريقه 2: د پرائمر غلظت تدریجي ترتیب کولو سره ډیبګ کول.لاندې انځور د یو شرکت څخه غلا شوی ترڅو روښانه کړي.لاندې شکل د فلوروسینس کمیتي پایلې ښیې چې د درې پرائمر غلظت تدریجي (100nM, 250nM, 500nM) او څلور سانچه غلظت تدریجي (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) سره رامینځته شوي.د تجربوي پایلو د Ct ارزښت په لاندې ډول ترتیب شوی دی:

د پریمر غلظت انتخاب په لاندې ډول د هر پریمر غلظت په یوه کرښه کې راټول کړئ:

د پریمر غلظت انتخاب څرګند دی ، د 100nM او 250nM د پریمر غلظت خطي اړیکه غوره ده ، او د 500nM د پریمر غلظت خطي اړیکه نسبتا خرابه ده.په 100nM او 250nM کې، د 250nM د Ct ارزښت نسبتا کوچنی دی، نو د غوره پریمر غلظت 250nM دی.په عمومي ډول شدید پریمر-ډیمرونه د خټکي په منحل کې لیدل کیدی شي.څه که چیرې ډیزاین شوي پریمر د پریمر - ډیمرونو څخه مخنیوی نشي کولی؟
طريقه 3: د پریمرونو اندازه کمه کړئ او د انیل کولو تودوخې زیات کړئ (د توضیح کولو ته اړتیا نشته).
د انیل کولو تودوخې تجربه ارزښت 60 درجې سانتي ګراد دی.که تاسو ډاډه نه یاست، څنګه د مناسب انیل کولو تودوخې غوره کول؟ځواب د پریمر غلظت انتخاب سره ورته دی -تدریجي ازموینه.د بایو راډ شرکت څخه یو عکس واخلئ ترڅو ستونزه روښانه کړي.د یوې ټاکلې موخې ټوټې د پراخولو لپاره، د تودوخې اته درجې ترتیب کړئ، هر یو د دریو تکرارونو سره، او ترلاسه شوي امپلیفیکیشن وکر په لاندې ډول دی:

د انیل کولو تودوخې انتخاب:
· 70 ° C، 69 ° C - اساسا، پریمرونه نشي یوځای کیدی، نو هیڅ پراخوالی شتون نلري.
· 67.3 °C - په پیل کې د پراخولو لږ مقدار شتون لري، او د Ct ارزښت نسبتا لوی دی.
·64.5°C——د Ct ارزښت کمیږي.
· په 60.7°C، 58.0°C، 56.2°C، او 55.0°C کې، د Ct ارزښتونه په اصل کې ثابت پاتې کېدل، مګر د وروستي فلوروسینس ارزښتونه توپیر درلود.
څنګه انتخاب کړئ؟اصول: لومړی اصل د Ct لوړ ارزښت دی.د ورته Ct ارزښت لپاره، د لوړ annealing تودوخې غوره کړئ ترڅو د ډیمیریزیشن او غیر مشخص لوړولو څخه مخنیوی وشي.که څه هم په 55 ° C کې د فلوروسینس لوړ ارزښت شتون لري، کیدای شي په دې کې dimers یا غیر مشخص پراخوالی وي.
مګر که تاسو د تاسو په څیر هوښیار یاست ، نو تاسو به خامخا فکر وکړئ: په منطقي توګه ، که د PCR عکس العمل خورا مشخص وي ، تر هغه چې د پریمر غلظت له لږترلږه اړتیا څخه ډیر وي ، لوړ او ټیټ ټکي باید هیڅ اغیزه ونلري ، لکه د فلوروسینټ رنګونو او dNTPs په څیر.په حقیقت کې، تر هغه چې د انیل کولو تودوخه په سمه توګه غوره شوې وي، د Ct ارزښت باندې د پریمر غلظت اغیز به په طبیعي توګه کم شي.

د انیل کولو تودوخه په سمه توګه غوره شوې، او په CT باندې د پریمر غلظت اغیز به کم شي
ثانوي جوړښت د امپلیفیکیشن موثریت اغیزه کوي
راځئ چې د Bio-rad څخه انځور واخلو ترڅو ستونزه روښانه کړي.دا د تودوخې درجه هم ډیزاین کوي ​​ترڅو د ثانوي جوړښت سره جین پراخ کړي.

ثانوي جوړښت راڅرګندېږي
دا لیدل کیدی شي لکه څنګه چې د تودوخې تدریجي کمیږي، محصولات څرګندیدل پیل کوي او د Ct ارزښت مخ په وړاندې ځي، په 60.7 ° C کې لږترلږه ارزښت ته رسیږي، او بیا کله چې د تودوخې درجه کمیږي، د Ct ارزښت لوی کیږي.برعکس، لکه څنګه چې د تودوخې زیاتوالی راځي، ثانوي جوړښت خلاصیږي او د لوړولو موثریت زیاتیږي.د یوې ټاکلې تودوخې ته رسیدو وروسته، د تودوخې زیاتوالی نشي کولی د لوړولو موثریت ته وده ورکړي.ځکه چې پریمر په دې وخت کې په ثبات سره یوځای نشي.له همدې امله،د ټیټ Ct ارزښت سره د حرارت درجه وګورئ، کوم چې د ثانوي جوړښت ټیمپلیټ پراخولو لپاره غوره تودوخه ده!البته، هوښیار احمقان باید پوه شي چې که دا اړینه نه وي، دا غوره ده چې پریمر بدل کړئ او د ثانوي جوړښت سیمې څخه ډډه وکړئ.
5. د غوښتنلیک کچه
MIQE - د معلوماتو تحلیل

د معلوماتو تحلیل په عمده توګه د فلوروسینټ کمیتي PCR وسیلې لخوا ورکول کیږي.په تیره مقاله کې، د ډیټا تحلیل ډیری کارونه ترسره شوي، لکه د خالي کنټرول، چې د تجربې په ډیزاین کې تشریح شوي.د داخلي حوالې جینونه، د تکرار شمیرې، او نور روښانه شوي.، دلته موږ په عمده توګه د qPCR غوښتنلیک تشریح کوو.
qPCR په پراخه کچه کارول کیږي، او تجربوي تصدیق او د نیوکلیک اسید تشخیص ترټولو عام کارول شوي سناریوګانې دي.
مطلق مقدار
Log (لومړني غلظت) د دورې د شمیر سره خطي اړیکه لري.یو معیاري وکر د پیژندل شوي لومړني کاپي شمیرې سره د معیار څخه اخیستل کیدی شي ، دا د امپلیفیکیشن عکس العمل خطي اړیکه ترلاسه کیدی شي.د نمونې د Ct ارزښت له مخې، په نمونه کې غلظت محاسبه کیدی شي.د شاملولو لپاره د ټیمپلیټ مقدار.

د مطلق مقدار محاسبه طریقه
مطلق مقدار باید د معیاري وکر پر بنسټ وي.د معیاري وکر جوړولو لپاره، یو معیار ته اړتیا ده.معمولا، معیاري پلاسمید دی چې د هدف جین کلون کولو له لارې ترلاسه کیږي.ولې پلاسمید دی؟ځکه چې د سرکلر پلازمیډ DNA خورا باثباته دی.معیاري محصول له 5 څخه تر 6 ګریډینټ کې د دوه چنده کولو تناسب (10-fold dilution) سره سم کم کړئ ، او د کمولو پرمهال یووالي ته پاملرنه وکړئ.اجازه راکړئ چې د Ct ارزښت د 15-30 ترمنځ راټیټ شي.

معیاري تیاری
په ورته وخت کې، د ازموینې نمونه باید هم د هغې مطابق حل شي (د کمولو فکتور په یاد ولرئ)، او د Ct ارزښت باید د 15-30 ترمنځ راټیټ شي.معیاري محصول + نمونه چې ازمول کیږي په ماشین کې یوځای کیښودل کیږي.د چلولو وروسته، د معیاري مادې سره یو معیاري وکر جوړ شو، او د ازموینې لپاره نمونې د غلظت محاسبه کولو لپاره معیاري وکر ته راوړل شوې.
د هیپاتیت بی ویروس HBV اندازه کول یو ځانګړی مطلق مقدار دی ، کوم چې کولی شي د وینې په 1 ملی لیتر کې د ویروس کاپي شمیره محاسبه کړي.
د کاپي شمیره محاسبه
د نمونې غلظت باید ازمول شي (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × د کمولو فکتور
د نمونې مالیکول وزن = د بندونو شمیر × 324
د ازموینې لپاره د نمونې د کاپي شمیره (کاپي/ul) = د ازمونې لپاره د نمونې غلظت / د نمونې مالیکولر وزن × 6 × 1014

د کاپي شمیرې حساب کولو طریقه

پورته د مقدار ټاکلو لپاره د محاسبې میتود دی.دا د ریاضیاتو ستونزه ده چې د لیسې څخه د فراغت وروسته حل کیدی شي، او د ریاضیاتو ستونزې عموما د کمپیوټر لخوا حل کیږي.که تاسو نه پوهیږئ، تاسو کولی شئ اړیکه ونیسئ.
نسبي مقدار
نسبي مقدار په عمده توګه په ساینسي څیړنو کې کارول کیږي.په 1 ملی لیتر وینه کې څومره ویروسونه شتون لري، او دا د DNA ویروس دی، دا نسبتا ټاکونکې پیښه ده: د وینې مقدار ټاکل کیدی شي، او د DNA ویروس نسبتا مستحکم وي.په هرصورت، دا زموږ لپاره ستونزمنه ده چې په یوه پاڼی کې د یو ځانګړي جین د نقل نقل شمیره پرتله کړو، ځکه چې د پاڼي اندازه، وزن او نرموالی معلومول ستونزمن کار دی، د استخراج شوي RNA اندازه معلومه کول ستونزمن دي، او د بیرته راګرځیدونکي لیږد موثریت معلومول هم ستونزمن دي، یعني هر ګام ممکن د تجربوي معلوماتو کارول نشي کولی.
نو ځکه، نسبي مقدار باید یو عنصر معرفي کړي:داخلي حواله جین
په بل عبارت، نسبي اندازه کول په حقیقت کې د هدف جین او داخلي حوالې جین ترمنځ پرتله کول دي.په ورته نسج او ورته حجرو کې پرتله کول، د نمونې اندازې نفوذ، د RNA استخراج اندازه، د نقل نقل کولو موثریت، او د PCR موثریت نسبتا کوچنی دی.د نمونې د کوچنۍ اندازې له امله، د داخلي حوالې جینونه او هدف جینونه نسبتا کم شوي.همدا لامل دی چې موږ پخوا هم پر یووالي او ثبات ټینګار کړی دی.
د داخلي حوالې جینونه عموما ديد کور ساتنې جینونه(د کور ساتلو جینونه)، کوم چې د جینونو ټولګي ته اشاره کوي کوم چې په ټولو حجرو کې په ثابت ډول څرګند شوي، او د دوی محصولات د حجرو د ژوند لومړني فعالیتونو ساتلو لپاره اړین دي.
دا مفهوم ګډوډ مه کوئ.د کور ساتلو جینونه د بیولوژیکي فعالیت شرایط دي، پداسې حال کې چې د داخلي حوالې جینونه تجربې تخنیکي اصطلاحات دي.د کور ساتنې جینونه مخکې له دې چې د داخلي حوالې جینونو په توګه وټاکل شي د اعتبار تصدیق کولو ته اړتیا لري.
د مثال په توګه، موږ په لاندې انځور کې د کور ساتونکي جینونه په مختلفو نسجونو حجرو کې د دوی د بیان کچه معاینه کولو لپاره غوره کړه، او وموندله چې د β-2-microglobulin بیان کچه د نورو دریو جینونو څخه خورا توپیر لري، نو دوی نشي کولی د داخلي حوالې جینونو په توګه وکارول شي.

د داخلي حوالې جین د اصلاح کولو فعالیت د پوهیدو وروسته، د داخلي حوالې جین د معرفي کولو له امله دوه الګوریتمونه اخیستل کیږي.
· دوه ګونی معیاري منحنی طریقه
·2 – △△Ct میتود (د CT ارزښت پرتله کولو طریقه)
که تاسو د نوعو او جین دندو مطالعې سره علاقه لرئ، مهرباني وکړئ د الګوریتم په اړه څیړنې پریږدئ او مستقیم فارمولونه وکاروئ، یا مستقیم ماشینونه وکاروئ؛که تاسو په ریاضیاتو او انجینرۍ کې مستقیم سړی یاست، مهرباني وکړئ وړیا احساس وکړئ.
دوه ګونی معیاري منحنی طریقه
د کنټرول نمونې هدف جین او د کور ساتلو جین اندازه کړئ او نمونه چې د معیاري منحني له لارې ازموینه کیږي، او بیا د محاسبې فورمول سره سم نسبي ارزښت محاسبه کړئ، کوم چې د نسبي بیان کچه ده.
ګټې: ساده تحلیل، نسبتا ساده تجربوي اصلاح
زیان: د هر جین لپاره، د تجربو هر پړاو باید یو معیاري وکر جوړ کړي
غوښتنلیک: یو له دوو خورا عام کارول شوي او پیژندل شوي نسبي کمیتي میتودونو څخه چې د جین بیان تنظیم کولو مطالعې کې
فورمول په لاندې ډول دی:

مثالونه په لاندې ډول دي:

د کمیتي پایلې پراساس نسبي مقدار محاسبه کړئ
2 – △△Ct میتود (د CT ارزښت پرتله کولو میتود)

ګټې: د معیاري وکر جوړولو ته اړتیا نشته
زیانونه: داسې انګیرل کیږي چې د لوړولو موثریت 100٪ ته نږدې دی؛معیاري انحراف د 5٪ څخه کم دی، او معیاري وکر او د هر امپریفیکیشن تر مینځ موثریت فرض کیږي چې ثابت وي؛د تجربوي شرایطو اصلاح کول خورا پیچلي دي.
غوښتنلیک: یو له دوو خورا عام کارول شوي او پیژندل شوي نسبي کمیتي میتودونو څخه چې د جین بیان تنظیم کولو مطالعې کې

البته، د لوړولو موثریت معمولا ناممکن دی 1. د سمون طریقه: که موږ پوهیږو چې هدف جین او د حوالې جین یو شان د لوړولو موثریت لري، مګر د لوړولو موثریت د 1 سره مساوي نه دی، نو 2－△△Ct په دې ډول سم کیدی شي: (1+C، د مثال لپاره) 0.95 دی، نو د محاسبې فورمول 1.95 ته سم کیدی شي－△△Ct
تر دې دمه ، د فلوروسینټ کمیتي PCR په اړه مینځپانګه پای ته رسیدلې.